榭皮素對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

馮莉芳,張玲莉

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 1.感染科; 2.藥學(xué)部，湖北 武漢 430060)

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榭皮素對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

馮莉芳1,張玲莉2

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 1.感染科; 2.藥學(xué)部，湖北 武漢 430060)

目的 探討榭皮素對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。方法 原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細(xì)胞，隨機(jī)分成對(duì)照組、H2O2(100 μmol/L)組、榭皮素組(Qu組)、AMPK抑制劑Compound C組(CC組)、H2O2+Qu組、H2O2+Qu+CC組，采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧，ELISA試劑盒檢測(cè)βA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)AMPK、p-AMPK及BACE1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 CCK8結(jié)果顯示，榭皮素可明顯降低H2O2對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞存活率的抑制作用，并可顯著降低H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS及βA的表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，榭皮素可通過(guò)激活A(yù)MPK，上調(diào)p-AMPK的表達(dá)水平來(lái)達(dá)到抑制BACE1酶的表達(dá)。結(jié)論 H2O2刺激神經(jīng)元細(xì)胞可上調(diào)氧化應(yīng)激水平，榭皮素可通過(guò)促進(jìn)AMPK的磷酸化，降低βA在細(xì)胞中的沉積，進(jìn)一步下調(diào)ROS在細(xì)胞中的表達(dá)，從而減緩了H2O2對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞造成的損傷。

榭皮素； 神經(jīng)元細(xì)胞； 氧化應(yīng)激

老年癡呆癥，又名阿爾茨海默癥，是一種進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病。研究表明體內(nèi)膽固醇平衡異常可引起神經(jīng)退行性病變[1]，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)高濃度膽固醇參與老年癡呆癥的發(fā)病過(guò)程，可直接調(diào)節(jié)淀粉樣前蛋白(APP)的分解過(guò)程，促進(jìn)β-淀粉樣蛋白(βA)在體內(nèi)的積累[2-3]。除此之外，膽固醇誘導(dǎo)的大腦氧化應(yīng)激和神經(jīng)元炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)大腦βA的積累并加快老年癡呆癥的發(fā)病過(guò)程。研究表明降膽固醇藥物(如他汀類藥物)可降低βA的合成及沉積，并可降低老年癡呆的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。

榭皮素(quercetin，Qu)，一種天然的黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化和抗炎癥活性，對(duì)神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、癌癥及肥胖均有良好的療效[6-11]。AMP激活蛋白激酶(AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝和能量平衡[12]，AMPK蘇氨酸(172位)磷酸化可減少活性氧(ROS)的合成[13]。因此，AMPK可能是治療H2O2引起的神經(jīng)元毒性的潛在靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以皮層神經(jīng)元細(xì)胞為模型，評(píng)估榭皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病的影響，并對(duì)其潛在的神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。

1 材料與儀器

1.1 材料

榭皮素(Sigma,CAS No.117-39-5，≥99%)；Compound C(AMPK抑制劑，SELLECK，≥99%)；DMEM培養(yǎng)基(Gibcol公司)；胎牛血清(FBS,Gibcol公司)；GAPDH抗體、p-AMPK抗體、AMPK抗體及BACE1抗體均購(gòu)自GeneTex (USA)；CCK-8試劑盒購(gòu)置武漢谷歌生物有限公司；ELISA試劑盒購(gòu)自Boster公司；原代大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞購(gòu)自基爾頓生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

ISO14644-1型超凈工作臺(tái)(天津泰斯特)；Spectra max plus 384型酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；Odyssey近紅外掃描儀(LI-COR Biosciences)。

2 方法與結(jié)果

2.1 神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)與分組

原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞用高糖培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)，成分包括10%(φ)FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗，于5%(φ)CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁便可用于細(xì)胞模型構(gòu)建及藥物處理。H2O2氧化損傷模型的建立以及H2O2濃度參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為6組：對(duì)照組、H2O2(100 μmol/L)組、榭皮素組(Qu組)、Compound C組(CC組)、H2O2+Qu組、H2O2+Qu+CC組。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.3Qu對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響

將神經(jīng)元細(xì)胞重懸后，以1×105個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，細(xì)胞分組同上。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到80%～90%后，棄去舊培養(yǎng)基，每組細(xì)胞加入相應(yīng)的Qu(10μg/mL)或CC(2μg/mL)處理細(xì)胞24h后，加入100μmol/L的H2O2處理細(xì)胞24h后，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入含10μLCCK8試劑新鮮培養(yǎng)基100μL，繼續(xù)培養(yǎng)1h后取出置于酶標(biāo)儀中，于450nm處測(cè)定吸光度值。結(jié)果如圖1所示，H2O2組和H2O2+Qu+CC組細(xì)胞存活率分別為(47.3±2.03)%、(51.7±3.12)%，顯著低于對(duì)照組細(xì)胞存活率(85.4±3.15)%；而H2O2+Qu組、CC組、Qu組細(xì)胞存活率分別為(72.5±2.64)%、(69.8±1.94)%和(68.4±2.45)%，顯著高于H2O2組細(xì)胞存活率，說(shuō)明Qu可以改善由H2O2引起的神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

1.對(duì)照組； 2.H2O2組； 3.H2O2+Qu組； 4.H2O2+Qu+CC組； 5.Qu組； 6.CC組(下同)。與對(duì)照組比較：*P<0.05；與H2O2組比較：#P<0.05。

圖1 榭皮素對(duì)H2O2處理的皮層神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響

Figure 1 Effect of quercetin on cell survival of neurons (n=3)

2.4 Qu對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞中ROS的影響

將神經(jīng)元細(xì)胞重懸后，以1×106個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，細(xì)胞分組同上。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到80%～90%后，棄去舊培養(yǎng)基，每組細(xì)胞加入相應(yīng)的Qu(10 μg/mL)或CC(2 μg/mL)處理細(xì)胞24 h后，加入100 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞24 h后，采用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS的含量。結(jié)果如圖2所示，H2O2組和H2O2+Qu+CC組細(xì)胞中ROS的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，而H2O2+Qu組、CC組、Qu組細(xì)胞中ROS的相對(duì)表達(dá)水平則顯著低于H2O2組細(xì)胞，說(shuō)明Qu可以降低由H2O2引起的神經(jīng)元細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

2.5 Qu對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞中βA40和βA42表達(dá)的影響

將神經(jīng)元細(xì)胞重懸后，以1×106個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，細(xì)胞分組同上。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)后，棄去舊培養(yǎng)基，每組細(xì)胞加入相應(yīng)的Qu(10 μg/mL)或CC(2 μg/mL)處理細(xì)胞24 h后，

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與H2O2組比較:#P<0.05。

圖2 榭皮素對(duì)H2O2處理的皮層神經(jīng)元細(xì)胞中ROS表達(dá)水平的影響

Figure 2 Effect of quercetin on the levels of ROS expression in neurons (n=3)

加入100 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞24 h后，采用ELISA試劑盒檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基中βA40和βA42的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3所示，H2O2組和H2O2+Qu+CC組細(xì)胞中βA40和βA42的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞；H2O2+Qu組、CC組、Qu組細(xì)胞中βA40和βA42的表達(dá)水平則顯著低于H2O2組細(xì)胞；而H2O2+Qu+CC組細(xì)胞中βA40和βA42的表達(dá)水平顯著低于H2O2組細(xì)胞(均為P<0.05)。說(shuō)明Qu可以降低由H2O2引起的神經(jīng)元細(xì)胞中βA40和βA42沉積，進(jìn)一步減少ROS的產(chǎn)生。

2.6 Qu對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞中AMPK、p-AMPK及BACE1表達(dá)水平的影響

將神經(jīng)元細(xì)胞重懸后，以1×106個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，細(xì)胞分組同上。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)后，棄去舊培養(yǎng)基，每組細(xì)胞加入相應(yīng)的Qu(10 μg/mL)或CC(2 μg/mL)處理細(xì)胞24 h后，加入100 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞24 h后，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，每孔上樣40 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行凝膠電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后一抗孵育過(guò)夜，洗膜3次后二抗孵育1 h，利用Odyssey近紅外掃描儀對(duì)GAPDH、AMPK、p-AMPK(Thr172)、BACE1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示，H2O2組和H2O2+Qu+CC組細(xì)胞中p-AMPK(Thr172)的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，而H2O2+Qu組、CC組、Qu組細(xì)胞中p-AMPK的表達(dá)水平則顯著高于H2O2組細(xì)胞；AMPK、BACE1在H2O2+Qu組、CC組、Qu組細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明Qu可以促進(jìn)AMPK的磷酸化，進(jìn)一步抑制了BACE1的表達(dá)，阻滯了APP向βA的轉(zhuǎn)變，達(dá)到改善神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激的損傷。

3 討論

綠茶、兒茶素、姜黃色素及榭皮素等黃酮類化合物對(duì)老年癡呆癥有著良好的治療效果[15]，其中榭皮素具有廣泛的藥理作用，生物活性較強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)評(píng)估了榭皮素對(duì)由H2O2誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激及神經(jīng)元毒性的保護(hù)作用，并對(duì)其潛在的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。AMPK在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、能量平衡和食物攝取過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[16]，AMPK的磷酸化可以增強(qiáng)脂肪酸氧化代謝過(guò)程，抑制脂肪酸、膽固醇、蛋白質(zhì)的生物合成代謝過(guò)程，并且AMPK的活化可以被劇烈運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)缺失及動(dòng)脈缺血缺氧所調(diào)控，還可以被天然化合物榭皮素或姜黃素所調(diào)控[17-18]。本實(shí)驗(yàn)中榭皮素可以促進(jìn)AMPK的磷酸化，導(dǎo)致p-AMPK在皮層神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，抑制了BACE1蛋白的表達(dá)，引起APP的γ裂解生成βA量降低，減少了βA在細(xì)胞中的沉積，進(jìn)一步降低了皮層神經(jīng)元細(xì)胞中氧化應(yīng)激的水平，改善了由H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

與對(duì)照組比較：*P<0.05； 與H2O2組比較:#P<0.05。 圖3 榭皮素對(duì)H2O2處理的皮層神經(jīng)元細(xì)胞中βA40和βA42表達(dá)水平的影響Figure 3 Effect of quercetin on the levels of βA40 and βA42 expression in neurons (n=3)

與對(duì)照組比較：*P<0.05； 與H2O2組比較：#P<0.05。
圖4 榭皮素對(duì)H2O2處理的皮層神經(jīng)元細(xì)胞中AMPK、p-AMPK(Thr172)、BACE1表達(dá)水平的影響
Figure 4 Effect of quercetin on the levels of AMPK,p-AMPK (Thr172) and BACE1 expression in neurons (n=3)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明榭皮素對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用部分依賴于AMPK的活化。除此之外，榭皮素能明顯降低βA40和βA42在細(xì)胞中的表達(dá)水平，并且這一過(guò)程可被AMPK抑制劑阻斷。說(shuō)明βA在細(xì)胞中的沉積可能是由于AMPK活化受到抑制而導(dǎo)致BACE1蛋白酶表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了APP的γ裂解。H2O2+Qu+CC組細(xì)胞中βA40和βA42的表達(dá)水平顯著低于H2O2組細(xì)胞，可能是因?yàn)殚科に剡€可通過(guò)其他通路來(lái)調(diào)節(jié)βA在皮層神經(jīng)元細(xì)胞中的沉積，而這些通路不被AMPK抑制劑所阻斷。綜上所述，榭皮素對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞所受氧化應(yīng)激的保護(hù)作用可通過(guò)激活A(yù)MPK來(lái)實(shí)現(xiàn)，通過(guò)減少βA在細(xì)胞中的沉積，降低ROS在細(xì)胞中的表達(dá)，起到改善神經(jīng)元毒性的效果。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Protection effect of quercetin on oxidative stress-induced cortical neuron injury

FENG Lifang，ZHANG Lingli

(1.DepartmentofInfectiousDiseases; 2.DepartmentofPharmacy,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To investigate the protective effect of quercetin on oxidative stress-induced cortical neuron injury. Methods Cortical neurons were cultured and grouped into six groups,including the control group,H2O2group,quercetin group,CC group,H2O2combined with quercetin group,and H2O2+ quercetin +CC group. Cell viability was detected by CCK8 assay. The level of ROS in cortical neuron was detected by ROS assay kit and the protein level of βA was detected by ELISA assay. Western blot was used to determine the expression of AMPK,p-AMPK and BACE1 proteins. Results Treatment with quercetin decreased the suppression of H2O2on cell viability and the expression of ROS and βA induced by H2O2. In addition,quercetin reduced the expression of BACE1 by upregulation of AMPK phosphorylation. Conclusion The level of oxidative stress in neurons could be upregulated by H2O2stimulation. Quercetin may inhibit the expression of ROS and βA via upregulation of AMPK phosphorylation,which alleviates H2O2-induced cortical neuron injury.

quercetin; neurons; oxidative stress

2016-07-11

馮莉芳，女，碩士，主管護(hù)師，主要從事中藥藥理學(xué)研究，Email:zhangwhu@hotmail.com。

時(shí)間：2016-10-19 15:28:12

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161019.1528.001.html

R965

A

1006-8783(2016)05-0609-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016071102