滴水珠組織培養體系的優化

朱燕燕，羅 睿，陳海麗，劉 丹

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

滴水珠組織培養體系的優化

朱燕燕，羅 睿＊，陳海麗，劉 丹

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

為縮短滴水珠（Pinelliacordata）的繁殖周期，促進其種質資源的保存與產業化利用，以滴水珠的葉片和葉柄為外植體，研究不同植物激素種類及其配比對滴水珠外植體組織培養的影響。結果表明：葉柄作為外植體較優；愈傷組織誘導及繼代培養最優條件為MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 1.0mg/L，只需7～15d即可轉接；分化及增殖最優條件為MS＋6-BA 2.0mg/L＋IBA 0.2mg/L，增殖倍數達9.2倍，時間僅需14d；生根培養最優條件為MS＋6-BA 0.1mg/L＋IBA 0.5mg/L＋活性炭0.5g/L，7d即可煉苗移栽。通過對各階段進行分步優化，繁殖周期縮短為44d，有利于滴水珠的產業化生產。

滴水珠；組織培養；植物激素；再生體系；藥用植物

滴水珠（PinelliacordataN.E.Br.）為天南星科（Araceae）半夏屬多年生草本植物，主要分布于我國浙江和貴州等地，是我國特有的重要天然藥用植物［1］。其塊莖含多種氨基酸和生物堿［2］（如，吲哚生物堿Neoechinulin A［3］）、微量元素［4］及多種化合物，主治毒蛇咬傷［5］及用于腫瘤病人的消腫止痛［6］，其凝集素顯示出明顯的抗蟲性［7］。滴水珠對環境要求較高，主要生長在巖石邊、巖隙中或巖壁上、林下溪旁以及潮濕草地，以無性珠芽繁殖為主［1］。隨生境改變和過度采挖，其自然分布區越來越窄，僅分布于難以采挖的巖隙和巖壁上。因此，人工培育滴水珠種苗是對其進一步開發利用的重要技術，組織培養是培育種苗的關鍵環節。李偉平等［8］在郁建新［9］研究的基礎上，對分化和生根培養基進行了篩選，但是其繁殖周期達89d；雖然王玉嬌等［10］通過改變激素配比，得到愈傷組織誘導的最佳組合，但繁殖周期依然沒有縮短，甚至更長，達7個多月［11］。因此，筆者擬通過改變激素種類和配比，重新篩選滴水珠組織培養各階段的最優配方，旨在提高滴水珠的繁殖效率和縮短繁殖周期，為產業化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 外植體 滴水珠植株采集于浙江省溫州市永嘉縣，2015年8月盆栽種植于貴州大學植物生理學實驗室，待長出新葉后，選取幼嫩的葉柄和葉片備用。

1.1.2 試劑 MS培養基、6-芐基嘌呤、α-萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸和無水氯化鈣等均為分析純。

1.1.3 其他 栽培基質，按土∶有機肥∶鋸末＝10∶1∶2混合拌勻。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 用軟毛刷刷洗葉柄和葉片表面泥土，洗潔精浸泡30min，流水沖洗2h，再將材料放入超凈工作臺用75%酒精消毒45s，0.1%的升汞消毒7min，無水乙醇沖洗3次，最后放入培養皿中濾干水分備用。

1.2.2 試驗設計 所有培養基均以MS為基礎培養基，添加3%蔗糖30g/L＋瓊脂8g/L，控制pH5.8～6.0。培養條件均為培養溫度（25±2）℃，光照強度2 000～2 500lx、光照時間為12h/d。

1）愈傷組織誘導。試驗設9個處理（表1），即在基礎培養基中分別添加不同配比的6-BA、NAA和2，4-D，以文獻［8］中的最佳培養基為對照（CK）。外植體滅菌后，葉柄切成大小為1cm左右的小段，葉片切成1cm×1cm大小，接種于愈傷組織誘導培養基中，每種處理接種48管。

表1 滴水珠愈傷組織誘導培養基不同激素的種類與配比Table 1 Types and proportion of various hormones for callus induction ofP.cordatamg/L

2）不定芽分化與增殖培養。不定芽分化試驗設6個處理（表2），即在基礎培養基中分別添加不同配比的6-BA、NAA和2，4-D，以文獻［8］中的最佳培養基為對照（CK）。不定芽增殖試驗設3個處理，在不定芽分化培養基礎上選取不定芽分化率較高的培養基、參考文獻［8］中分化率高的P1及任意培養基P3等3種進行試驗。愈傷組織形成后將其轉移至不定芽培養基中進行不定芽分化培養，每種處理接種50個；待不定芽分化出綠色芽點后，將不定芽轉接到增殖培養基進行增殖培養，每種處理接種50個。

表2 滴水珠不定芽分化和增殖培養基不同激素的種類與配比Table 2 Types and proportion of various hormones for adventitious bud differentiation and proliferation ofP.cordatamg/L

3）生根培養。試驗設2個處理，T1，生根培養基為MS＋0.1mg/L 6-BA＋0.5mg/L IBA＋ 0.5g/L活性炭；T2，生根培養基為1/2MS＋NAA 0.25mg/L［8］（CK），每種處理接種小苗72個。即待小苗長到一定高度后，轉入生根培養基中培養。

4）煉苗和移栽。組培苗生長10d左右，取3批共180株生長健壯、根系形成良好且株高為5～10cm的組培苗，揭開蓋子放置3～5d，然后取出組培苗用水洗凈根部的培養基，轉種于栽培基質，澆透水后置于20～25℃及50%濕度的遮蔭環境下培養，每2d澆水1次。

1.3 數據統計分析

采用DPS軟件進行統計分析。

愈傷組織誘導率＝（產生的愈傷組織數/接種外植體數）×100%

芽分化率＝（出現芽的愈傷組織塊數/接種的愈傷組織塊數）×100%

增殖倍數＝（叢生芽總數/接種總苗數）×100

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對愈傷組織的誘導效果

從表3可知，1）葉柄外植體。接種葉柄（圖示A）外植體在9種培養基中均可誘導產生愈傷組織，M2、M7與M8間誘導率差異不顯著，與其他處理間差異顯著。其中，M4的誘導率最高，達60%；其次是M3，達55%。在6-BA濃度為1mg/L時，隨NAA濃度的升高，愈傷誘導率降低，而2，4-D則相反；當6-BA濃度為2mg/L時，隨NAA和2，4-D濃度的升高，愈傷誘導率均升高，且 NAA為1mg/L時，誘導率達最大（圖示B）。當6-BA與NAA比值為2∶1時，愈傷組織誘導率均升高；而2，4-D＋6-BA組合的誘導效果較6-BA＋NAA組合差。2）葉片外植體。接種葉片外植體在9種培養基中，除M2外，其他處理均可誘導產生愈傷組織（圖示C），M3與M6，M5與M9處理間差異性均不顯著，與其他處理間差異顯著。其中，M4誘導率最高，達57%。6-BA濃度為1mg/L，隨著2，4-D濃度的增加，誘導率呈先減后增，其他處理則與葉柄的一致。說明，滴水珠葉柄和葉片誘導愈傷組織的最適激素組合為2mg/L 6-BA＋1mg/L NAA。

表3 不同激素配比滴水珠不同愈傷組織的誘導培養效果Table 3 Callus induction effects under different hormone combinations %

圖示 滴水珠組織培養快繁體系的不同階段Fig. Different stages of rapid propagation system ofP.cordata

2.2 不同激素配比對不定芽分化與增殖培養效果

1）不同激素配比不定芽的分化效果依次為P5（100%）＞P1（90%）＞P2（70%）＞P3（67%）＞P6（60%）＞P4（45%）。在NAA濃度不變情況下，隨6-BA濃度升高，不定芽的分化率不斷降低。2mg/L 6-BA＋0.2mg/L IBA分化率達100%。經差異顯著性分析，P1和P5差異不顯著，但二者與其他處理間差異顯著；P2與P3差異不顯著，但與其他處理間差異顯著。P5不定芽7～12d即可進行增殖，且不定芽長勢較好（圖示E），芽整齊度高。說明，P5（2mg/L 6-BA＋0.2mg/L IBA）為不定芽分化的最佳激素配比。

2）從表4可知，不定芽的長勢和增殖倍數均依次為P5＞P3＞P1。P5不定芽增殖倍數最高，7d即達9.2倍（圖示F）；P1不定芽只能維持基本生長，并不增殖；P3不定芽增殖倍數為4.3倍，3組的增殖倍數差異較大，差異顯著。

表4 不同培養基處理不定芽的增殖效果Table 4 Proliferation of adventitious buds in different culture medium

2.3 組培苗生根、煉苗與移栽

觀察發現，T1的小苗發根株數為72個，生根率為100%，根系發達（圖示G），有5～9根，主根長度最長可達10cm，植株高度可達8～12cm；而T2的小苗發根株數只有50株，生根率為69%，根的長勢一般。選取經煉苗后生長健壯、根系形成良好，葉片2～3，株高8cm左右的植株（圖示H）進行移栽，1個月后其成活率達100%（圖示I）。

2.4 繁殖周期

在最佳培養基上，愈傷組織誘導時間為10d，不定芽分化時間為7d，增殖培養基上培養7d即可轉接到生根培養基上，培養10d后可進行煉苗移栽，繁殖周期為44d。

3 結論與討論

滴水珠的葉柄和葉片在添加激素2.0mg/L 6-BA＋1.0mg/L NAA培養基上愈傷組織誘導率較高，且6-BA＋NAA組合誘導效果優于6-BA＋2，4-D組合。該研究結果與劉鑫欣等［12］愈傷組織誘導的激素以6-BA為主，NAA其次，而2，4-D影響不顯著的結論一致，但與李偉平等［8，10］研究結果不同。可能本試驗使用的材料與其所用材料的基因型不同，因而最適的激素種類不同。林婭等［13-15］的研究也證明，NAA誘導愈傷組織的效果優于2，4-D。

在添加激素2.0mg/L 6-BA＋0.2mg/L IBA處理下，不定芽分化率較李偉平等［8，10］提高12%，分化時間縮短7d。表明，細胞分裂素與生長素相互作用，當二者比值高時可誘導不定芽正常分化［16］；該研究細胞分裂素與生長素比（10∶1）高于李偉平等［8，10］的試驗比例（2∶1），可能是導致不定芽分化率提高、時間縮短的主要原因。

通過優化激素種類和配比，獲得增殖和繼代培養的最優激素種類為2.0mg/L 6-BA和0.2mg/L IBA，2種激素的用量比例為10∶1。聞麗等［17］的研究表明，6-BA與IBA的組合適合油茶花藥愈傷組織的進一步繼代培養，6-BA與IBA組合是否適用于更多植物的繼代培養，有待研究。

該研究表明，在MS培養基＋0.1mg/L 6-BA＋0.5mg/L IBA＋0.5g/L活性炭條件下，不定芽生根數目、質量以及所用時間均優于李偉平等［8，10］。推測可能是因為活性炭創造的黑暗條件有利于根的誘導和根系的生長［18］。

滴水珠的愈傷組織誘導繁殖周期為44d，與之前滴水珠繁殖周期最快89d［8］相比，縮短培養周期1/2。王玉嬌等［10］曾對滴水珠的愈傷組織誘導進行優化，但并未縮短其繁殖周期；其認為，材料增殖再多但不生根就不是一株完整的植株［19］。因此，要獲得最優的培養體系，應對各環節進行優化。

［1］Flora of China編委會.《中國植物志》英文修訂版［M］.北京：科學出版社、密蘇里植物園出版社聯合出版，2010，23（20）：40-41.

［2］樓之岑，秦 波.常用中藥材品種整理和質量研究［J］.北京：北京大學醫學出版社，2003：.

［3］王 琦，趙云麗，高曉霞，等.中藥滴水珠中Neoechinulin A的分離及測定［J］.色譜，2009，27（4）：509-512.

［4］徐照輝，朱夢娜，吳巧鳳.滴水珠中總生物堿和微量元素的含量測定［J］.廣東微量元素科學，2005，11（10）：37-40.

［5］田莎莎，李偉平，沈嫣婧，等.半夏、天南星和滴水珠抗五步蛇毒中毒作用的研究［J］.中藥藥理與臨床，2013，29（3）：136-138.

［6］宋立人，洪 恂，丁緒亮，等.現代中藥學大辭典［M］.北京：人民衛生出版社，2001.

［7］LIN L，JIE L，TANG K X，et al.Molecular Cloning and Characterization of a Mannose-Binding Lectin Gene from Pinellia Cordata［J］.Molecular Biology Reports，2008，35（4）：641-647.

［8］李偉平，馬丹丹，蔣福升，等.滴水珠組培快繁的實驗研究［J］.北京聯合大學學報（自然科學版），2012，26（3）：46-51.

［9］郁建新.滴水珠的組織培養和植株再生［J］.植物生理學通訊，1988，13（4）：37.

［10］王玉嬌，李偉平，葉溫平，等.滴水珠組織培養及快速繁殖的實驗研究［J］.中華中醫藥學刊，2012，30（12）：2710-2713.

［11］楊 仙，馬丹丹，蔣福升，等.滴水珠原生質體的分離純化與植株再生［J］.中國中藥雜志，2014，39（21）：4211-4215.

［12］劉鑫欣，崔曉星，劉金欣，等.不同植物生長調節劑對半夏愈傷組織誘導效應的研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2011，18（5）：57-59.

［13］林 婭，鄭玉梅，劉青林.影響月季愈傷組織誘導和分化的因素［J］.分子植物育種，2006，4（2）：223-227.

［14］白文苑，沈慧敏.蒼耳愈傷組織誘導及繼代培養研究［J］.甘肅農業大學學報，2006，41（1）：65-68.

［15］王玉珍，董玉惠.霍霍巴的組織培養與快速繁殖［J］.植物生理學通訊，2005，41（6）：835-840.

［16］張 峰，陳麗靜.細胞工程［M］.北京：中國農業大學出版社，2014.

［17］聞 麗，張日清，李典軍.不同激素配比對油茶花藥愈傷組織形成的影響［J］.經濟林研究，2005，23（4）：21-23.

［18］劉用生，李友勇.植物組織培養中活性炭的使用［J］.植物生理學通訊，1994，30（3）：214-217.

［19］邢亞娟.中國山楊與美洲山楊雜交種新品系選育研究［D］.哈爾濱：東北林業大學，2005.

（責任編輯：王 海）

Tissue Culture System Optimization ofPinelliacordata

ZHU Yanyan，LUO Rui＊，CHEN Haili，LIU Dan
（CollegeofLifeScience，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China）

In order to shorten the reproductive cycle ofP.cordataand promote the preservation and industrialization utilization of the genetic resources，leaves and petioles were used for explants，the effects of different types of plant hormones on the tissue culture were studied.Results：Petiole was proved to be the best explants for callus inducing.The best conditions for callus induction was MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 1.0mg/L.Differentiation and propagation culture with medium MS＋6-BA 2.0mg/L＋IBA 0.2mg/L could increase the proliferation ratio which could reach 9.2.The rooting medium（MS）supplied with IBA 0.5mg/L＋6-BA 0.1mg/L＋AC 0.5g/L was optimal.The test-tube plantlets could be transplant after 7days of rooting culture.The reproduction cycle was shortened to 44d，which was beneficial for industrialization production ofP.cordata.

Pinelliacordata；tissue culture；phytohormone；regeneration system；medicinal plant

S567.2

A

2016-03-26；2016-08-20修回

國家自然科學基金項目“半夏珠芽發育的激素調節和關鍵調控基因克隆研究”（31560081）；貴州大學創新基金項目“滴水珠珠芽發育的形態解剖學研究”（研農2016006）

朱燕燕（1989-），在讀碩士，研究方向：植物生理學。E-mail：15761622057＠163.com

＊通訊作者：羅 睿（1974-），副教授，碩士生導師，從事發育生物學研究。E-mail：luorui＿physiol＠126.com

1001-3601（2016）09-0393-0101-04