Toll樣受體3基因缺陷促進四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化損傷

薛如意　張丹瑛　吳昊　劉韜韜　董玲　沈錫中

(復旦大學附屬中山醫(yī)院消化內科，上海　200032)

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·論著·

Toll樣受體3基因缺陷促進四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化損傷

薛如意張丹瑛吳昊劉韜韜董玲沈錫中

(復旦大學附屬中山醫(yī)院消化內科，上海200032)

摘要目的： 探討Toll樣受體3(Toll-like receptor 3，TLR3)基因缺陷對于四氯化碳誘導的肝纖維化小鼠模型肝纖維化損傷程度的影響。方法： 將20只野生型雄性小鼠和20只TLR3基因缺陷型(TLR3-/-)雄性小鼠分別分為野生型對照組、野生型造模組、TLR3-/-對照組和TLR3-/-造模組，每組各10只。對照組腹腔注射玉米油，造模組腹腔注射四氯化碳。造模8周后采集血液標本，應用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、白蛋白(albumin，ALB)水平；采用馬松三色染色法對肝組織膠原沉積程度進行分析；采用α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)免疫組織化學染色法檢測肝星狀細胞的激活情況；應用試劑盒檢測肝組織中的羥脯氨酸含量；采用實時熒光定量PCR法檢測肝組織中纖維化標志物Ⅰ型膠原、炎性因子[包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和單核細胞趨化因子1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1) ]以及促纖維化分子[包括轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子1( tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)和血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)]的表達。結果： TLR3基因缺陷對于四氯化碳誘導的肝纖維化小鼠血清中的ALT、AST、TBIL、ALB水平變化無影響。TLR3基因缺陷可加重四氯化碳誘導的肝組織膠原沉積和肝星狀細胞激活；促進四氯化碳誘導的小鼠肝組織中羥脯氨酸的升高；使四氯化碳誘導的肝纖維化標志物Ⅰ型膠原增多，也使肝組織中炎性因子TNF-α、IL-6和 MCP-1以及促纖維化分子TGF-β、TIMP1和PDGFR表達升高。結論： TLR3基因缺陷可促進四氯化碳誘導的肝纖維化小鼠肝組織中的膠原沉積和肝星狀細胞激活，促進肝組織炎性因子釋放，使肝促纖維化分子上調。以上提示，TLR3是肝纖維化病理過程中的一個保護性基因。

關鍵詞Toll樣受體3；基因缺陷小鼠；四氯化碳；肝纖維化

Toll-Like Receptor 3 Gene Deficiency Aggravates Carbon Tetrachloride-Induced Liver Fibrosis in Mice

XUERuyiZHANGDanyingWUHaoLIUTaotaoDONGLingSHENXizhong

DepartmentofGastroenterologyandHepatology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective： To investigate the effect of Toll-like receptor 3(TLR3) gene deficiency on the degree of liver fibrosis in mouse model of carbon tetrachloride(CCl4)-induced liver fibrosis.Methods： A total of 20 wild-type male mice and 20 male mice with TLR3 gene deficiency(TLR3-/-) were divided into wild-type control group and wild-type model group,TLR3-/-control group and TLR3-/-model group, respectively, with 10 mice in each group.The control group was injected with corn-oil by intraperitoneal injection while the model group was injected with CCl4by intraperitoneal injection.After 8 weeks,blood sample was collected and serum level of alanine aminotransferase(ALT), aspartate transaminase(AST), total bilirubin(TBIL), and albumin(Alb) was analyzed by automatic biochemical analyzer. And the degree of collagen deposition in liver tissue was evaluated by Masson trichrome staining.And the activation of hepatic stellate cells was detected by immunohistochemistry staining of α-smooth muscle actin(α-SMA). And hydroxyproline content of liver tissue was detected with detection kit.Furthermore, real-time fluorescence polymerase chain reaction was used to detect the expression of liver fibrotic marker type I collagen,and inflammatory cytokines including tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-6(IL-6) and monocyte chemotactic protein-1(MCP-1), as well as pro-fibrotic molecule including transforming growth factor-beta(TGF-β),tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP1) and platelet-derived growth factor receptor(PDGFR).Results： TLR3 gene deficiency had no effect on CCl4-induced change regarding serum level of ALT,AST,TBIL,ALB.TLR3 gene deficiency aggregated the CCl4-induced collagen deposition and hepatic stellate cell activation in liver tissue. And it promoted the CCl4-induced elevation of hydroxyproline content and expression increase of fibrotic marker type I collagen. Furthermore, the expression increase of inflammatory cytokines including TNF-α,IL-6 and MCP-1,as well as that of pro-fibrotic molecule including TGF-β,TIMP1 and PDGFR, was promoted.Conclusions： TLR3 gene deficiency could promote liver collagen deposition and hepatic stellate cell activation in mouse model of CCl4-induced liver fibrosis, and it could promote inflammatory cytokine release and pro-fibrotic molecule up-regulation. All above suggest that TLR3 is a protective gene during liver fibrosis pathological process.

Key WordsToll-like receptor 3;Mouse with Gene deficiency;Carbon tetrachloride;Liver fibrosis

肝纖維化是許多慢性肝臟疾病晚期共有的病理生理過程，其病理特征為多種致病因素引起的肝臟纖維結締組織的異常增生。在早期階段，肝纖維化是可逆的。但是，如果肝損傷的原因持續(xù)存在，長期肝纖維化可演變?yōu)楦斡不垢闻K發(fā)生永久的不可逆的損傷，甚至發(fā)展為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。近年來，模式識別受體所介導的肝臟炎性反應和肝纖維化間的關系已成為肝纖維化發(fā)病機制研究中的一個新熱點[2-5]。

本研究選用Toll樣受體3(Toll-like receptor 3，TLR3)基因缺陷型(TLR3-/-)小鼠，通過化學損傷(四氯化碳)誘導肝纖維化模型，探討TLR3基因缺陷對于肝纖維化指標和肝炎性反應指標的影響。

1資料與方法

1.1實驗動物和材料野生型小鼠B6129SF2/J和TLR3-/-小鼠B6.129S1-Tlr3tm1Flv/J購自美國Jackson實驗室。四氯化碳(Sigma-31996)、玉米油(Sigma-C8267)、馬松三色染液(Sigma-HT15)、α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Sigma-A2547)購自美國Sigma公司；多聚甲醛和10%甲醛固定液購自湖北武漢博士德生物有限公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2通過四氯化碳誘導建立肝纖維化模型將雄性8～10周齡(25～30 g)的野生型小鼠20只和TLR3-/-小鼠20只飼養(yǎng)于復旦大學動物部無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級動物房，采用12 h光/暗周期，給予常規(guī)食物和水。選取野生型和TLR3-/-小鼠各10只為模型組，腹腔注射四氯化碳(用玉米油稀釋至20%)，給藥劑量為6 μL/g，每周3次，連續(xù)8周。另選取野生型和TLR3-/-小鼠各10只為對照組，腹腔注射與模型組等量的玉米油。8周后處死所有小鼠，小鼠處死前12 h禁食、禁飲。

1.3肝功能和肝纖維化檢測應用美國Beckman Coulter有限公司生產的AU5800系列全自動生化分析儀檢測小鼠血清中的肝功能指標，包括丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、白蛋白(albumin，ALB)。肝纖維化檢測：將小鼠肝臟置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，采用馬松三色染色法分析肝組織膠原沉積程度；采用α-SMA免疫組織化學染色法檢測肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活情況以確定肝纖維化的狀態(tài)；另外應用南京建成生物有限公司的試劑盒測定肝組織羥脯氨酸含量。

1.4實時熒光定量PCR取小鼠肝組織0.1 g，加入1 mL TRIzol(美國Invitrogen公司)后冰上勻漿。提取肝臟總RNA，應用美國賽默飛世爾科技公司的Nanodrop微量紫外分光光度計檢測RNA濃度，按照寶生物工程(大連)有限公司反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。應用美國ABI公司的7500型實時熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR，檢測肝組織纖維化標志物Ⅰ型膠原、炎性因子[包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和 單核細胞趨化因子1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)]以及促纖維化分子[包括轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)和血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)]的mRNA表達水平，以ΔΔC t法計算， 最終以2-ΔΔC t值作為基因表達的定量值，相關引物由上海生工生物技術有限公司合成，序列見表1。

表1　實時熒光定量PCR引物序列

注：內參照GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

2結果

2.1各組小鼠肝功能指標比較與相應對照組比較，野生型和TLR3-/-小鼠造模組血清AST、ALT、TBIL值均明顯增高，ALB降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TLR3-/-造模組小鼠血清AST、ALT、TBIL和ALB與野生型造模組的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

±s)

注：與野生型對照組比較，*P<0.05；與TLR3-/-對照組比較，#P<0.05

2.2各組小鼠肝纖維化指標比較與相應對照組比較，野生型和TLR3-/-小鼠造模組肝組織中膠原纖維沉積明顯較多，表現(xiàn)為馬松三色染色陽性細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與野生型造模組比較，TLR3-/-造模組小鼠肝組織中膠原纖維沉積較多，表現(xiàn)為馬松三色染色陽性細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1和表3。

表3　各組小鼠肝組織馬松三色染色及α-SMA免疫組織

注：與野生型對照組比較，*P<0.05；與TLR3-/-對照組比較，#P<0.05；與野生型造模組比較，△P<0.05

A：野生型對照組；B：TLR3-/-對照組；C：野生型造模組；D：TLR3-/-造模組圖1　各組肝組織馬松三色染色(×100)

與對照組比較，野生型和TLR3-/-小鼠造模組HSC激活明顯增加，表現(xiàn)為α-SMA免疫組織化學染色陽性細胞比例增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與野生型造模組比較，TLR3-/-造模組小鼠HSC激活明顯增加，表現(xiàn)為α-SMA免疫組織化學染色陽性細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2和表3。

A：野生型對照組；B：TLR3-/-對照組；C：野生型造模組；D：TLR3-/-造模組圖2　各組肝組織α-SMA免疫組織化學染色(×100)

2.3各組小鼠肝組織中羥脯氨酸含量比較與相應對照組比較，野生型和TLR3-/-小鼠造模組肝組織中羥脯氨酸含量均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 與野生型造模組比較， TLR3-/-造模

組小鼠肝組織中羥脯氨酸含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

±s)

注：與野生型對照組比較，*P<0.05；與TLR3-/-對照組比較，#P<0.05；與野生型造模組比較，△P<0.05

2.4實時熒光定量PCR檢測各組小鼠肝組織中纖維化標志物Ⅰ型膠原及炎性因子和促纖維化分子的表達情況與相應對照組比較，野生型和TLR3-/-小鼠造模組肝組織中纖維化標志物Ⅰ型膠原，炎性因子TNF-α、IL-6和MCP-1以及促纖維化分子TGF-β、TIMP1和PDGFR的表達水平上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與野生型造模組比較，TLR3-/-造模組小鼠肝組織中纖維化標志物Ⅰ型膠原，炎性因子TNF-α、IL-6和 MCP-1以及促纖維化分子TGF-β、TIMP1和PDGFR的表達上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5　各組小鼠肝組織纖維化標志物Ⅰ型膠原及炎性因子和促纖維化分子的表達水平(2- ΔΔC t)

注：與野生型對照組比較，*P<0.05；與TLR3-/-對照組比較，#P<0.05；與野生型造模組比較，△P<0.05

3討論

肝纖維化受到多種先天免疫系統(tǒng)組件的控制，包括體液因子(如補體和干擾素)、吞噬細胞(如中性粒細胞和巨噬細胞)、淋巴細胞(如NK細胞和NKT細胞)和模式識別受體[如Toll樣受體(TLR)][6]。肝臟負責完成80%～90%的先天免疫蛋白(包括補體和模式識別受體)的生物合成。小鼠肝淋巴細胞含有10%的NK細胞，而大鼠和人肝淋巴細胞含有30%～50%的NK細胞。獲得性免疫系統(tǒng)在肝臟中并不活躍，因為肝臟是T細胞凋亡的主要器官。先天免疫系統(tǒng)在對病原體的先天防御以及肝損傷、修復和纖維化進程中發(fā)揮關鍵作用。

先天免疫系統(tǒng)通過多種模式識別受體識別細菌產物的成分，受體與病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)識別并結合后，調節(jié)肝纖維化的發(fā)生。其信號機制包括活化核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)，拮抗細胞凋亡，誘導DNA損傷，引起組織損傷修復反應，抑制細胞自噬，改變氧化應激和線粒體應激狀態(tài)，利用NK細胞殺傷HSC等。TLR對病原體相關分子模式的識別是天然免疫的基礎，使機體能對病原體作出快速有效的反應，啟動細胞活化和炎性信號轉導。

TLR在肝臟中有9種成員，即TLR1~9。研究[6]顯示：TLR4被細菌內毒素活化后，可以激活NF-κB途徑，引起HSC活化，促進肝纖維化。我們[7]近期發(fā)現(xiàn)，TLR2受體活化后，可以通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)和NF-κB信號通路，引起HSC活化，促進肝纖維化。本研究選用TLR3基因缺陷型小鼠，通過四氯化碳誘導肝纖維化模型，探討了TLR3對于肝纖維化的影響。結果發(fā)現(xiàn)，TLR3基因缺陷促進了化學毒物誘導肝纖維化，表現(xiàn)為：TLR3基因缺陷增加了膠原纖維的沉積，增強了HSC的激活，提高了肝組織中羥脯氨酸的含量；TLR3增加了肝組織纖維化標志物之一的Ⅰ型膠原，肝組織炎性因子TNF-α、IL-6和 MCP-1以及促纖維化分子TGF-β、TIMP1和PDGFR的水平。

TLR3在肝組織中主要分布于NK細胞和枯否細胞。其中，NK細胞對于HSC的活化有重要的調節(jié)作用。研究[8]發(fā)現(xiàn)，TLR3受體可以調節(jié)NK細胞的功能。在體外用TLR3的配體——多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，poly I:C)處理NK細胞，可以提高NK細胞的細胞殺傷毒性，殺傷活化的HSC，從而抑制HSC的活化。在小鼠體內實驗也發(fā)現(xiàn)，poly I:C處理小鼠造成TLR3活化后，能夠提高NK細胞的細胞殺傷毒性。基于這些研究和本研究的結果，我們提出了這樣的假設：TLR3受體可能是一個肝臟重要的抗纖維化受體，它通過調節(jié)NK細胞的殺傷毒性，抑制HSC的活化，抑制炎性因子和促纖維因子的釋放，從而抑制膠原沉積的纖維化進程，而將這一重要的抗纖維化受體基因敲除后，可加重肝纖維化進程。本研究結果為抗肝纖維化治療提供了新的潛在靶點，以TLR3受體為干預靶點的抗纖維化策略可能有潛在的臨床應用價值。

參考文獻

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]Seki E,De Minicis S,Osterreicher CH,et al.TLR4 enhances TGF-beta signaling and hepatic fibrosis[J].Nat Med,2007,13(11):1324-1332.

[3]Jagavelu K,Routray C,Shergill U,et al.Endothelial cell toll-like receptor 4 regulates fibrosis-associated angiogenesis in the liver[J].Hepatology,2010,52(2): 590-601.

[4]Mencin A,Kluwe J,Schwabe RF.Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases[J].Gut,2009,58(5):704-720.

[5]Junjie X,Songyao J,Minmin S,et al.The association between Toll-like receptor 2 single-nucleotide Polymorphisms and hepatocellular carcinoma susceptibility[J].BMC Cancer,2012,12:57.

[6]Jeong WI,Gao B.Innate immunity and alcoholic liver fibrosis[J].J Gastroenterol Hepatol,2008,23(Suppl 1):S112-S118.

[7]Ji L,Xue R,Tang W,et al.Toll like receptor 2 knock-out attenuates carbon tetrachloride(CC14)-induced liver fibrosis by downregulating MAPK and NF-kappa B signaling pathways[J]. FEBS Lett,2014,588(12):2095-2100.

[8]Radaeva S,Sun R,Jaruga B,et al.Natural killer cells ameliorate liver fibrosis by killing activated stellate cells in NKG2D-dependent and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-dependent manners[J].Gastroenterology, 2006,130(2):435-452.

中圖分類號R575.2

文獻標志碼A

通訊作者薛如意，E-mail: xue.ruyi@zs-hospital.sh.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：81572308)