秦皇島地區狐源致病性E.coli對四環素類藥物耐藥性和耐藥基因的檢測

張召興，李蘊玉，賈青輝，張香齋，張艷英，耿田田，李佩國

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室，河北秦皇島，066600)

秦皇島地區狐源致病性E.coli對四環素類藥物耐藥性和耐藥基因的檢測

張召興，李蘊玉，賈青輝，張香齋，張艷英，耿田田，李佩國*

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室，河北秦皇島，066600)

為了確定秦皇島地區狐源大腸桿菌(E.coli)對四環素類藥物的耐藥性和耐藥基因分布，采用常規的鑒定方法，從不同養狐場送檢的腹瀉的狐貍體內分離鑒定出20株E.coli。致病性試驗表明，該菌為致病性E.coli。藥敏試驗結果表明：分離菌株對四環素和強力霉素藥率分別達到95%和90%。通過PCR方法檢測分離菌株四環素類藥物的耐藥基因，結果顯示，tetA和tetB基因的檢出率分別為100%和95%。本研究為秦皇島地區防治狐源致病性大腸桿菌病提供實驗基礎。

狐貍；E.coli；四環素；PCR；耐藥基因；秦皇島地區

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)引起的一類疾病的總稱[1]。E.coli是一種人畜共患細菌，可以引起人及不同動物發病[2]。該菌可以引起不同動物腹瀉、腸炎、甚至脫水而死，也可以引起其他的器官感染[3]。相關的報道E.coli攜帶致病性毒力島，能引起水貂腹瀉，且呈急性死亡[4]。E.coli對四環素類藥物有強的耐藥性，主動外排和核糖體保護作用是四環素產生耐藥的機制[5]。

筆者通過對秦皇島地區狐源E.coli分離鑒定，探索該菌對四環素類藥物的耐藥性和耐藥基因機制的攜帶情況。從分子生物學角度分析秦皇島地區狐源E.coli對四環素類藥物產生耐藥的原因，為秦皇島地區狐源E.coli防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源

秦皇島地區不同養殖場送檢的腹瀉的狐貍，采集肝、心等組織分離培養。

1.2 試劑及儀器

ID32E腸道菌鑒定試劑條由法國梅里埃(bioMerieuxsa)公司生產；DL2000 Marker，2×Taq Marker Mix，Gold View核酸染液和樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司；常規試劑由本實驗室提供。

1.3 實驗動物

約20 g健康BALB/c小白鼠84只，引自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.4 細菌分離純化

無菌采集肝臟劃線接種于麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養12～24 h。在普通瓊脂培養基進行純化培養。

1.5 細菌形態特征

無菌挑取上述純化培養菌，經革蘭氏染色鏡檢。

1.6 細菌生化特性鑒定

用ID32E腸道菌鑒定試劑條和自動ATB生化儀進行生化試驗。

1.7 致病性試驗

將實驗小鼠分為試驗組與空白對照組，每組4只。試驗組每只小鼠0.2 mL(109CFU/mL)腹腔注射；空白對照組每只小鼠注射等量生理鹽水。觀察發病及死亡情況，分離細菌并鑒定。

1.8 藥敏試驗

按照美國臨床檢驗標準委員會推薦的標準K-B紙片法進行試驗和結果判斷[6]。

1.9 引物設計

參考相關文獻[7]，并設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴增引物序列

1.10 細菌DNA模板提取

按樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書操作，存于-20 ℃備用。

1.11 耐藥基因PCR檢測

PCR擴增反應體系(25μL)：模板DNA，2 μL；上下游引物，各0.5 μL；2×Taq Marker Mix，12.5 μL；ddH2O，9.5 μL。

反應條件：94 ℃預變性，5 min；94 ℃變性，50 s；退火(見表1)，50 s；72 ℃延伸，50 s；72 ℃終延伸，10 min。共30個循環。

擴增產物取出5 μL電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 細菌分離純化與形態觀察

麥康凱瓊脂培養基上長出具有粉紅色、邊緣光滑整齊、濕潤的扁圓的菌落；伊紅美蘭培養基上長出深紫黑色、帶金屬光澤的圓形菌落。在普通瓊脂平板上，形成白色、光滑濕潤的菌落。染色鏡檢，兩端鈍圓，呈桿狀的革蘭氏陰性桿菌(圖1)。

圖1 革蘭氏染色陰性(10×100)

2.2 生化試驗結果

20株分離菌株均能發酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖,產酸不產氣，不分解尿素。菌株不利用蔗糖，吲哚試驗為陽性，用ATB全自動生化鑒定系統進行檢測分析，鑒定結果為E.coli，評定結果合格率為99.9%。

2.3 致病性試驗

試驗組小鼠大約24 h全部發病死亡，分離培養鑒定。結果顯示所分離菌與該病原菌一致。對照組4只小白鼠健康存活，表明該菌有一定致病性。

2.4 藥敏試驗

20株狐源E.coli對四環素類藥物中的四環素、強力霉素兩種藥物均耐藥，對四環素的耐藥率為95%，對強力霉素耐藥性為90%(表2)。

2.5 耐藥基因PCR檢測結果

該菌對tetA基因檢出率100%(圖1)；tetB基因檢出率95%(圖2)；該菌對株tetA和tetB同時檢出率為95%。

表2 20株狐源E.coli對四環素類的藥物的耐藥結果(n=20)

注：S，高度敏感；I，中度敏感；R，耐藥。

圖1 PCR結果(tetA基因)

圖2 PCR結果(tetB基因)

3 結論與討論

在秦皇島地區不同的養狐場分離的20株病原菌，對其分離菌從形態特征觀察、培養特性分析、生化鑒定等多方面鑒定，確定為E.coli，與《伯杰細菌鑒定手冊》中報道的E.coli的特性一致[8]。通過致病性試驗，該菌有一定致病性。證實該地區分離的20株狐源E.coli均為致病性E.coli，該菌是引起不同日齡狐貍腹瀉的主要病原菌。

本次試驗對從腹瀉狐貍體內分離的20株致病性大腸桿菌，對四環素類藥物中常用的四環素、強力霉素進行了藥敏試驗，結果表明：20株致病性大腸桿菌對兩種藥有很強的耐藥性。四環素類的藥物是常用的廣譜抗生素，被廣泛用于動物的治療及細菌性疾病的預防。主要的抗菌機理為阻止氨酰tRNA與核糖體的結合位點的結合來阻止細菌蛋白質的合成[5]。其主要的耐藥機制為：主動外排作用、核糖體保護作用、產生滅活四環素的酶以及一種未名機制，通常認為主動外排和核糖體保護作用是四環素產生耐藥的機制，以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌就是以主動外排為主[9]。對于狐源致病性大腸桿菌對四環素類的藥物耐藥的研究報道很少，對四環素產生很強的耐藥性，可能與致病性大腸桿菌本身對該類藥物的耐藥機制有關。

tetA和tetB是四環素主要耐藥基因。該試驗對秦皇島地區的狐源E.coli對四環素類藥物tetA和tetB基因進行了檢測，試驗表明了該菌攜帶tetA和tetB基因100%和95%。多重耐藥性達95%。Bryan等對人及動物體內分離的E.coli通過對四環素類藥物的tetA和tetB耐藥基因分析具有很高的檢出率[9]。相關報道四環素耐藥基因tetA和tetB對豬源E.coli攜帶率為27%和59%[10]。該試驗結果與報道的四環素類藥物的耐藥基因的檢測分析基本一致。秦皇島地區狐源E.coli對四環素類藥物產生很強的耐藥性，除了對四環素類藥物的不合理或高劑量的使用之外，也可能是接合質粒上耐藥基因發生轉移導致該菌產生耐藥性[5]。對四環素類藥物的耐藥機制再做進一步研究提供基礎。

[1] 陳薄言.獸醫傳染病學[M].第5版.北京:中國農業出版社,2006.

[2] 費恩格,李德昌,丁壯.動物疫病學[M].北京:中國農業出版社,2004.

[3] 房海,陳翠珍,張曉君.腸桿菌科病原細菌[M].北京:中國農業科學技術出版社,2011.

[4] 史秋梅,張艷英,房海,等.腹瀉水貂檢出攜帶耶爾森菌HPI毒力島的大腸桿菌[J].中國獸醫學報, 2012,32(6):857-861.

[5] Roberts M C.Update on acquired tetracycline resistance genes[J].FEMS Microbiology Letters,2005,245(2):195-203.

[6] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from anima1s: approved standard, seconded[J].NCCLS document M31-A2 Wayne USA,2000,49(21)105-126.

[7] 牛建寧,崔恩慧,唐攀,等.雞源致病性大腸桿菌對四環素類抗生素耐藥性及耐藥基因檢測[J].西北農業學報,2014,23(11):35-39.

[8] R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].第8版.北京:科學出版社,1984.

[9] 牛建寧.雞源大腸桿菌的分離鑒定及四環素類耐藥基因檢測研究[D].楊凌:西北農林科技大學,2014.

[10] Bryan A,Shapir N,Sadowsky M J.Frequency and distribution of tetracycline resistance genes in genetically diverse, nonselected, and nonclinicalEscherichiacolistrains isolated from diverse human and animal sources[J].Appl Environ Microbiol,2004,70(4):2 503-2 507.

[11] Kozak G K,Boerlin P,Janecko N,et al.Antimicrobial resistance inEscherichiacoliisolates from swine and wild small mammals in the Proximity of swine farms and in natural environments in Ontario,Canada[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(3): 559-566.

(責任編輯：朱寶昌，陳于和)

Resistance of PathogenicE.coliIsolated from Qinhuangdao Foxes to Tetracycline Antibiotics and Detection of Resistance Genes

ZHANG Zhaoxing, LI Yunyu, JIA Qinghui, ZHANG Xiangzhai, ZHANG Yanying,GENG Tiantian, LI Peiguo

(Hebei Normal University of Science & Technology, Hebei Province Key Laboratory of Veterinary Preventive Medicine, Qinhuangdao Hebei, 066600, China)

In order to understand the resistance of pathogenicE.colioriginated from the foxes in Qinhuangdao area to tetracycline antibiotics and distribution of resistance genes, twentyE.colistrains were isolated and identified from inspection diarrhea fox body in different fox farms. The results showed that all the isolated strains expressed pathogenically. The drug sensitivity test indicated that the isolated strains were highly resistant to tetracycline and doxycycline. The detection rate of drug resistance to tetracycline and doxycycline might reach 95% and 90%, respectively. PCR detection implied the detection rates of tetracycline resistance genestetA andtetB were as high as 100% and 95%, respectively. The research would provide an experimental basis for the prevention and treatment of the fox-derived pathogenicE.coliin Qinhuangdao area.

fox;E.Coli;tetracycline;PCR;resistance gene;Qinhuangdao area

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.02.010

秦皇島市農業科學研究院項目(項目編號：2014-04)。

2016-05-11; 修改稿收到日期: 2016-06-13

S852.61+2

A

1672-7983(2016)02-0055-04

張召興 (1988-)，男，在讀碩士研究生。主要研究方向：獸醫微生物學與免疫學。

*通訊作者，男，教授，博士。主要研究方向：動物疫病防控技術。E-mail: lpeiguo@163.com。