從江香豬CYP1A2基因4個外顯子的多態性

楊家大，任 瓊，吳聲榕

（1.凱里學院環境與生命科學學院，貴州凱里556011；2.貴州省從江縣農業局，貴州從江557400；3.凱里學院圖書館，貴州凱里556011）

從江香豬CYP1A2基因4個外顯子的多態性

楊家大1，任 瓊2，吳聲榕3

（1.凱里學院環境與生命科學學院，貴州凱里556011；2.貴州省從江縣農業局，貴州從江557400；3.凱里學院圖書館，貴州凱里556011）

為探明從江香豬細胞色素P450氧化酶CYP1A2基因的標簽SNPs，以及積累從江香豬藥物代謝酶的基礎資料，采用直接測序法對從江香豬CYP1A2基因外顯子1、4、5和6進行多態性分析。結果表明：第1外顯子存在11個多態位點（g.98G→A、g.147C→G、g.189C→T、g.198C→T、g.211A→G、g.231C→T、g.328T→C、g.338C→A、g.352T→C、g.458G→A和g.778G→A），優勢基因型分別為GG、CC、TT、CC、GG、CC、CC、AA、CC、AA和AA，優勢等位基因分別為G、C、T、C、G、C、C、A、C、A和A，多態信息含量為0.073 2～0.160 0，有效等位基因數為1.082 3～1.212 7，純合度為0.827 3～0.920 9，雜合度為0.079 1～0.172 7，香農信息指數為0.166 6～0.318 7，群體處于Hardy－Weinberg平衡狀態（P＞0.05）。第4外顯子存在1個多態位點g.1087C→G，優勢基因型為CC，優勢等位基因為C，多態信息含量為0.3642，有效等位基因數為1.918 8，純合度為0.673 8，雜合度為0.326 2，香農信息指數為0.671 8，群體偏離Hardy－Weinberg平衡（P＜0.05）。第5、6外顯子未發現多態性。從江香豬CYP1A2基因第1外顯子多態位點豐富，位點純合度高、變異性小，具備藥物代謝動物模型開發的良好基礎，但多態信息含量不足，連鎖分析或關聯分析時需謹慎選擇。第4外顯子多態位點少，但位點的多態信息含量合適，可用作連鎖分析及關聯分析的標簽SNP。

從江香豬；CYP1A2；標簽SNPs；多態性

豬尤其是小型豬在組織器官結構及生理生化指標等方面與人相似［1］，食性也與人類接近，且其實驗倫理問題不及靈長類動物和犬突出，加上易繁殖，生產成本較低，已廣泛用作醫學實驗動物模型。從江香豬產于貴州省從江縣，是我國稀有的優良地方微型豬種，具有個體矮小、近交程度高、外形均一、性格溫馴、與人親近等優良特性，是培育實驗動物的理想資源［2］，在疾病模型、新藥臨床前評價、食品安全、異種器官移植等領域具有一定的應用前景。

細胞色素P450氧化酶（Cytochrome P450enzymes，CYP）是存在于肝臟的微粒體混合功能氧化酶系的主要成分，是一組由許多同工酶組成的超基因大家族，對體內許多內源性物質和外源性化合物的生物轉化有重要作用［3］。CYP1A是其亞家族之一，人體內包含CYP1A1和CYP1A2。CYP1A1是一種芳香烴羥化酶，主要參與代謝活化多環芳烴類致癌物，在外源物代謝中占2.5%，分布在肺、皮膚、胃腸道、淋巴、胎盤、喉和腦等，在肝臟含量很低［45］。CYP1A2則主要存在于肝臟，其含量占肝臟總CYP的13%，在腦、肺、腸道等組織也有少量分布。CYP1A2與藥物代謝關系密切，參與咖啡因、非那西丁、醋氨酚、17β－雌二醇、普洛萘爾、維拉帕米、硝苯地平、丙咪嗪、茶堿等20多種藥物的代謝，約占CYP代謝藥物總量的4%。此外，CYP1A2還在10多種前致癌物的代謝激活或滅活中發揮重要作用，其活性變化與藥物的藥效或毒理相關［67］。豬及小型豬肝臟存在人CYP1A2的同源酶［89］。國內小型豬品系巴馬香豬和貴州小型香豬的肝微粒體也檢測到人CYP1A2樣酶［1011］。豬CYP1A2活性具有性別差異，雄性低于雌性［1213］，雌性與去勢公豬相當［13］，去勢公豬高于雄性豬［14］。在mRNA和蛋白質水平，去勢公豬也高于非去勢公豬［15］。在豬肝臟或原代培養肝細胞［1617］、心房、心室及冠狀動脈［1820］，CYP1A2均可被β－萘黃酮誘導，而在呼吸道及嗅黏膜、大腦皮質、小腦、中腦和海馬沒有誘導作

用［18－20］。

P450的遺傳多態性是造成不同個體對同一藥物反應差異的主要原因之一，是人類個體化用藥方案的重要理論依據［21］。在導致人CYP1A2活性個體差異的因素中，基因多態性起決定性作用［22］，目前已發現4個單核苷酸多態性可以影響人CYP1A2的活性［3］。NCBI數據庫顯示，豬CYP1A2基因DNA序列登錄號為NC＿010449.4，全長6 596bp，由6個外顯子、5個內含子和上下游調控序列組成，共發現228個SNP；CDS全長1 551bp，包含24個錯義突變和25個同義突變。其中，第1外顯子長831個核苷酸，編碼277個氨基酸；包含25個SNP，11個為錯義突變。第2外顯子長121個核苷酸，編碼（含參加編碼）41個氨基酸；包含3個SNP，1個為錯義突變。第3外顯子長90個核苷酸，編碼（含參加編碼）31個氨基酸；包含1個SNP，且此SNP為錯義突變。第4外顯子長124個核苷酸，編碼（含參加編碼）42個氨基酸；包含10個SNP，5個為錯義突變。第5外顯子長87個核苷酸，編碼（含參加編碼）30個氨基酸；包含3個SNP，2個為錯義突變。第6外顯子長298個核苷酸，編碼（含參加編碼）100個氨基酸；包含7個SNP，4個為錯義突變。因此，豬CYP1A2基因cSNP主要分布于外顯子1、4、5和6。目前，豬CYP1A2基因所有SNP位點均未登記有等位基因頻率，也未見有關等位基因頻率的文獻報道。鑒于此，應用直接測序法分析從江香豬CYP1A2基因第1、4、5和6外顯子的單核苷酸多態性，以獲取這些位點的群體遺傳學數據，為CYP1A2標簽SNPs的篩選提供參考依據，為從江香豬藥物代謝模型的開發提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 組織樣品

從江香豬141頭，來自貴州省從江縣宰便、加鳩、加勉、光輝、加榜和剛邊等鄉鎮，健康無病，2～3月齡，體重8～11kg。屠宰后取出肝臟組織，經生理鹽水沖洗血污后，置液氮中凍存。

1.2 肝臟DNA的提取

取5～20mg肝臟，加液氮研磨成粉末，轉移至1.5mL離心管中，按照離心柱型細胞／組織基因組DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司，GK0122）說明書提取DNA，稀釋至5～10ng／μL備用。

1.3 引物的設計與合成

根據豬CYP1A2基因（登錄號：NC＿010449.4）DNA序列及其第1、4、5和6外顯子的位置，應用primer premier 5.0設計PCR引物（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 CYP1A2基因4個外顯子的PCR引物信息Table1 PCR primer informations of four exons of gene CYP1A2

1.4 PCR擴增

反應體系50μL：基因組DNA 1μL，10×buffer 5μL，25mmol／L MgCl25μL，10mmol／L dNTP 1μL，10μmol／L上、下游引物各1μL，5U／μL Taq DNA聚合酶1μL，加去離子水補足至50μL。反應程序：94℃預變性3min；94℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35個循環；72℃延伸3min。

1.5 擴增產物的電泳及純化

PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，切割目的條帶，按照PCR產物純化試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司，GK2051）進行純化。

1.6 DNA測序

PCR產物回收純化后，由上海捷瑞生物工程有限公司測序，平臺為ABI 3730XL DNA序列分析儀，測序方法為sanger法。

1.7 基因型判定

應用ContigExpress Application（InforMax公司）打開測序生成后綴為“ab1”的文件，得到測序圖譜。測序圖譜經拼接后，如果某一核苷酸位置在不同個體之間出現2種或2種以上顏色波峰即視為多態位點。多態位點是單一波峰的個體為純合子，是2個波峰的個體為雜合子。測序峰圖顏色與堿基（核苷酸）的對應關系：A－綠色，T－紅色，C－藍色，G－黑色。

1.8 統計分析

采用基因計數法計算基因型頻率，用軟件Pop－Gen 32統計等位基因頻率、有效等位基因數、純合度、雜合度、香農信息指數、多態位點數以及Hardy－Heinberg平衡的χ2值和P值，用軟件PIC＿Calc 0.6計算多態信息含量（polymorphism information content，PIC）。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增

經2%瓊脂糖凝膠電泳發現，第1、4、5和6外顯子的擴增產物片段大小均與預期結果一致，且條帶清晰明亮、無雜帶（圖1），說明擴增具有特異性，PCR產物可用于后續試驗。

圖1 CYP1A2基因4個外顯子PCR產物的電泳圖譜Fig.1 Electropherogram of PCR products of four exons of gene CYP1A2

2.2 基因測序及基因型

第1外顯子共有139份從江香豬樣品獲得測序結果，發現11個變異，分別為g.98G→A、g.147C→G、g.189C→T、g.198C→T、g.211A→G、g.231C→T、g.328T→C、g.338C→A、g.352T→C、g.458G→A和g.778G→A。經NCBI數據庫檢索，這些變異均已有登記，對應的SNP位點分別為rs696347208、rs330578830、 rs341454408、rs325811564、rs343586092、rs336994947、rs328324843、rs343560684、rs334669395、rs345763403和rs321841283。g.98G→A位點的基因型分別為GG和GA，g.147C→G位點分別為CC、CG和GG，g.189C→T位點分別為CC、CT和TT，g.198C→T位點分別為CC、CT和TT，g.211A→G位點分別為AA、AG和GG，g.231C→T位點分別為CC、CT和TT，g.328T→C位點分別為TT、TC和CC，g.338C→A位點分別為CC、CA和AA，g.352T→C位點分別為TT、TC和CC，g.458G→A位點分別為GG、GA和AA，g.778G→A位點分別為GG、GA和AA（圖2）。

第4外顯子有141份從江香豬樣品獲得測序結果，發現1個變異，即g.1087C→G，該變異在NCBI數據庫中也有登記，對應SNP位點為rs334218835。g.1087C→G位點的基因型分別為CC、CG和GG（圖3）。第5、6外顯子在所有從江香豬樣品中均未發現多態位點。

2.3 遺傳變異

第1外顯子有11個位點呈現多態，多態位點數為11，核苷酸序列的變異頻率為1.32%（11／831），核苷酸變異位點占第1外顯子已知核苷酸變異總位點數的44.00%（11／25）。11個變異位點中，錯義突變7個，氨基酸序列的變異頻率為2.53%（7／277），氨基酸變異位點占第1外顯子已知氨基酸變異總位點數的63.64%（7／11）。第4外顯子只有1個位點呈現多態，多態位點數為1，核苷酸序列的變異頻率為0.81%（1／124），核苷酸變異位點占第4外顯子已知核苷酸變異總位點數的10.00%（1／10）；該位點變異類型為錯義突變，氨基酸序列的變異頻率為2.38%（1／42），氨基酸變異位點占第4外顯子已知氨基酸變異總位點的20.00%（1／5）。第5、6外顯子均未發現多態，多態位點數為0。

2.4 基因型頻率、基因頻率和多態信息含量

從表2看出，第1外顯子多態位點g.98G→A的優勢基因型為GG，頻率為0.920 9；G是優勢等位基因，頻率為0.960 4。g.147C→G位點的優勢基因型為CC，頻率為0.820 1；C是優勢等位基因，頻率為0.902 9。g.189C→T位點的優勢基因型為TT，頻率為0.8201；T是優勢等位基因，頻率為0.906 5。g.198C→T位點的優勢基因型為CC，頻率為0.820 1；C是優勢等位基因，頻率為0.902 9。g.211A→G位點的優勢基因型為GG，頻率為0.820 1；G是優勢等位基因，頻率為0.902 9。g.231C→T位點的優勢基因型為CC，頻率為0.827 3；C是優勢等位基因，頻率為0.906 5。g.328T→C位點的優勢基因型為CC，頻率為0.820 1；C是其優勢基因，頻率為0.902 9。g.338C→A位點的優勢基因型為AA，頻率為0.820 1；A是優勢等位基因，頻率為0.9 0 2 9。g.352T→C位點的優勢基因型為CC，頻率為0.820 1；C是優勢等位基因，頻率為0.902 9。g.458G→A位點的優勢基因型為AA，頻率為0.820 1；A是優勢等位基因，頻率為0.902 9。g.778G→A位點的優勢基因型為AA，頻率為0.834 5；A是優勢等位基因，頻率為0.913 7。第4外顯子多態位點g.1087C→G的優勢基因型為CC，頻率為0.439 7；C是優勢等位基因，頻率為0.602 8。

圖2 CYP1A2基因第1外顯子11個變異位點的測序Fig.2 Sequencing maps of 11polymorphism loci of gene CYP1A2 exon 1

圖3 CYP1A2基因第4外顯子g.1087C→G位點的測序Fig.3 Sequencing maps of g.1087C→G polymorphism locus of gene CYP1A2 exon 4

第1外顯子的11個多態位點均處于Hardy－Weinberg平衡狀態（P＞0.05），第4外顯子的多態位點g.1087C→G偏離Hardy－Weinberg平衡狀態（P＜0.05）。

第1外顯子11個多態位點的多態信息含量介于0.073 2～0.160 0，第4外顯子為0.364 2。

2.5 遺傳多樣性

12個多態位點的等位基因數均為2，未發現復等位基因。第1外顯子11個多態位點的有效等位基因數介于1.082 3～1.212 7，純合度介于0.827 3～0.920 9，雜合度介于0.0791～0.172 7，香農信息指數介于0.166 6～0.318 7；第4外顯子多態位點的有效等位基因數為1.918 8，純合度為0.673 8，雜合度為0.326 2，香農信息指數為0.671 8（表3）。

表2 CYP1A2基因第1、4外顯子的基因型頻率、等位基因頻率和多態信息含量Table2 Genotype frequences，allele frequences and polymorphism information contents of gene CYP1A2 exon 1and 4

表3 CYP1A2基因第1、4外顯子的遺傳多樣性指標Table3 Genetic diversity indexes of gene CYP1A2 exon 1and 4

3 結論與討論

從江香豬CYP1A2基因第1外顯子多態位點數量較多，核苷酸變異位點、對應氨基酸變異位點占總變異位點的比例均較高，說明多態位點較豐富，DNA序列及氨基酸序列的保守性較低。然而，這些變異位點的最小等位基因頻率很小，優勢基因的基因頻率與最小等位基因頻率差異幾乎相差1個數量級，優勢基因占絕對地位，表明這些位點的純合度高。而且這些位點的PIC值都低于0.25，屬于低度多態，也說明這些位點核苷酸變異較小，多態性低。香農信息指數、雜合度和有效等位基因數作為度量群體遺傳變異的最適參數及衡量遺傳多樣性的重要指標［2324］，也證實這些位點的變異性小，遺傳多樣性匱乏，基因純合，穩定性好，具備藥物代謝動物模型開發的良好基礎。第4外顯子的多態位點數量少，核苷酸變異位點、對應氨基酸變異位點占總變異位點的比例均較低，說明多態位點不足。該變異位點優勢基因的基因頻率與最小等位基因頻率差異不大，PIC介于0.25～0.5，屬于中度多態，基因雜合度較高，純合度相對較低，有效等位基因數接近實際等位基因數，香農信息指數較高，表明該位點的遺傳變異較大，遺傳多樣性較豐富，選育空間大，在藥物代謝動物模型培育方面具有潛力。

第1外顯子的多態位點豐富，群體中各位點的基因型頻率和等位基因頻率符合Hardy－Weinberg平衡，但遺傳多樣性匱乏；第4外顯子的多態位點不足，但群體遺傳多樣性豐富，各位點的基因型頻率和等位基因頻率偏離Hardy－Weinberg平衡。產生這一現象的原因可能與樣本量偏小有關。多態位點較多而檢測樣本量偏少，部分多態位點僅在少數個體中出現［25］。豬CYP1A2基因第4外顯子共有10個多態位點，但本研究中僅檢測出1個，極有可能是包含這些變異的個體沒有錄入樣本庫。此外，上述現象也可能包含了品種形成中的自然選擇和人工選擇效應。第4外顯子的雜合度較高，第1外顯子的雜合度低，或許還與基因“永不純合”現象有關。馮書堂等［26］對五指山小型豬近交家系的研究發現，涉及代謝過程和細胞過程、維持生命活動所必需的基因總是存在一些雜合位點，且各對染色體之間的雜合度不盡相同。

第5、6外顯子未發現多態位點，除了與這2個片段自身包含的多態位點總數較少以及檢測的樣本數量不大有關以外，或許還與SNP分布的品種差異有關。商海濤等［27］研究小型豬CYP3A29基因時發現，SNP的分布與遺傳背景有關，貴州小型豬與巴馬香豬的SNP位點存在差異。

在生物學功能與SNP關聯性的分析中，等位基因頻率是標簽SNPs篩選的一個重要參考因素［28］。實際工作中，人們常選擇最小等位基因頻率大于0.25的位點。從江香豬第1外顯子11個多態位點的最小等位基因頻率均小于0.25，因此這些位點在關聯分析時意義不大。多態信息含量用于連鎖分析時對標志基因（或標志序列）的多態性進行估計［29］，大于0.5的（共顯性遺傳的）標志基因具有高度信息，小于0.5而大于0.25的則具有合適信息，小于0.25的包含很少信息［30］。本研究中，PIC顯示這些位點屬于低度多態，在進行家系連鎖分析或功能關聯研究時應用價值不大，應謹慎選擇。第4外顯子雖然僅檢測到1個多態位點，但其最小等位基因頻率大于0.25，且多態信息含量大于0.25，屬于中度多態，具有合適的信息量，加上該位點變異類型屬于錯義突變，其變異導致氨基酸一級結構的改變，對應的氨基酸替代為P363A，即由脯氨酸突變為丙氨酸。脯氨酸是一種帶有環狀結構的亞氨基酸，在二級結構中常常出現在β－轉角處，導致肽鏈拐彎轉向，突變成丙氨酸后肽鏈就有可能不再拐彎而是變成α－螺旋或β－折疊結構總體向前延伸，最終有可能改變CYP1A2的酶特性和藥物代謝能力。因此，該位點在家系連鎖分析和功能關聯研究中意義更大，可用作標簽SNP。

致謝：在樣本收集過程中得到貴州省從江縣農業局副局長諶洪光、從江香豬特色食品有限責任公司從江香豬加工廠廠長蘭學銘的幫助，在此一并感謝！

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（責任編輯：馮 衛）

Polymorphisms of Four Exons in Congjiang Xiang－pig Gene CYP1A2

YANG Jiada1，REN Qiong2，WU Shengrong3
（1.College of Environmental and Life Sciences，Kaili University，Kaili，Guizhou556011；2.Agricultural Bureau，Congjiang County of Guizhou Province，Congjiang，Guizhou557400；3.Library，Kaili University，Kaili，Guizhou 556011，China）

Polymorphisms of Congjiang Xiang－pig gene CYP1A2 exon 1，4，5and 6were detected，in order to discover the tag SNPs in pig gene CYP1A2 and accumulate basic data of drug metabolism enzyme of Congjiang Xiang－pig.Results showeDThat 11polymorphic loci（g.98G＞A，g.147C＞G，g.189C＞T，g.198C＞T，g.211A＞G，g.231C＞T，g.328T＞C，g.338C＞A，g.352T＞C，g.458G＞A and g.778G＞A）existed in exon 1，the preponderant genotype were GG，CC，TT，CC，GG，CC，CC，AA，CC，AA and AA respectively，the preponderant allele were G，C，T，C，G，C，C，A，C，A and A respectively，polymorphism information contents were 0.0732to 0.1600，the numbers of effective alleles were 1.082 3 to 1.212 7，homozygosities were 0.8273to 0.9209，heterozygosities were 0.079 1to 0.172 7，Shannon information indexes were 0.166 6to 0.3187，and population was in Hardy－Weinberg equilibrium state（P＞0.05）.one polymorphic locus，i.e.g.1087C＞G existed in exon 4，the preponderant genotype was CC，the preponderant allele was C，polymorphism information content was 0.3642，the effective number of alleles was 1.9188，homozygosity was 0.6738，heterozygosity was 0.326 2，Shannon’s information index was 0.6718，and population deviated from Hardy－Weinberg equilibrium（P＜0.05）.No polymorphism was detected in exon 5and 6.It was indicateDThat genetic polymorphism loci of CYP1A2 gene exon 1in Congjiang Xiang－pig are rich，and have properties of high homozygosities and low genetic variabilities，which lay the foundation for using Congjiang Xiang－pig as animal model of drug metabolism.But，because polymorphism information contents are insufficient，these polymorphism loci should be cautious when linkage analysis and（or）association analysis are conducted.In exon 4，the number of genetic polymorphism loci is few，but polymorphism information content is appropriate，which hint this genetic polymorphism locus can be used as the tag SNP for linkage analysis and（or）association analysis.

Congjiang Xiang－pig；CYP1A2；tag SNP；polymorphism

S828

A

1001－3601（2016）10－0430－0084－07

2016－08－02；2016－09－26修回

國家自然科學基金項目“貴州小型香豬細胞色素氧化酶P450酶系的分子生物學基礎研究”（81460572）

楊家大（1975－），副教授，博士，從事地方特色畜禽品種資源的開發利用研究。E－mail：yangjiada2＠163.com