諾麗果汁對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用

譚琳++鄭曉燕++陳嬌+++鄭學勤+++馬蔚紅+艾斌凌++王朝政

摘要：為了探討諾麗果汁對過氧化氫誘導的PC12細胞氧化損傷的保護作用，本試驗采用H2O2造成PC12神經細胞氧化損傷模型，通過熒光顯微鏡觀察細胞形態，MTT測定細胞存活率、乳酸脫氫酶（LDH）活力檢測法，Ho/PI染色檢測細胞凋亡和細胞壞死，研究的諾麗果汁對過氧化氫所致PC12 細胞氧化損傷的影響。結果發現，體積分數在1%～5%諾麗果汁均能不同程度地保護細胞形態，增加細胞的生存率，抑制過氧化氫誘導的PC12細胞壞死，減少損傷后LDH的生成。以上結果表明，1%～5%體積分數諾麗果汁對過氧化氫誘導的PC12細胞損傷有保護作用。

關鍵詞：諾麗果汁；H2O2；PC12細胞；細胞壞死；乳酸脫氫酶

中圖分類號： TS275.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0317-03

收稿日期：2015-03-24

基金項目：中國熱帶農業科學院海口實驗站科研啟動項目（編號：HKZKY140204）；農業部財政項目“熱帶野生果樹種子資源收集、利用和評價”。

作者簡介：譚琳（1974—），女，博士，副研究員，研究方向為食品分子營養。E-mail：tanlin7402@126.com。

通信作者：馬蔚紅，研究員，主要從事熱帶作物種質資源收集與評價研究，E-mail：zjwhma@163.com；鄭學勤，研究員，主要從事熱帶作物遺傳育種研究。E-mail：zhengxxxqin@126.com。氧化應激是由活性氧自由基和活性氮自由基產生和清除失衡引起的應激損傷狀態[1]，在中樞神經系統退行性疾病中起著重要作用[2-3]。近年來，越來越多的研究顯示植物多酚具有強抗氧化性，且在防治氧化損傷神經退行性疾病有著重要的作用[4-5]。諾麗（Morinda citrifolia），又稱諾尼、海巴戟，屬茜草科巴戟天屬植物，主要分布在南太平洋諸島嶼以及中國的海南島、西沙群島和臺灣島等地[6]。早在2 000多年前，南太平洋島嶼的波利尼西亞人就發現諾麗果實具有天然的健康和醫學功效，經常將諾麗果壓成汁液，作為日常飲品和用于治療癌癥、糖尿病、高血壓等多種疾病[7]。現代醫學也表明諾麗具有抗氧化、抗癌、降糖等多種生物學活性[8-10]，但是關于其神經保護方面的功能鮮見報道。前期研究表明諾麗果汁中多酚含量高達1.934 mg/mL，且對DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥自由基、過氧化氫等均具有很好的清除活性[11]。本研究利用H2O2誘導類神經細胞系PC12細胞產生氧化損傷模型，檢測諾麗果汁對PC12細胞的保護作用，旨在為新型諾麗果汁保健產品的開發奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞PC12高分化細胞（大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株）購于中國學科院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫。

1.1.2諾麗果汁諾麗果由鄭學勤研究員采自海南陸僑集團三亞種植基地，將采來的新鮮諾麗果實去皮和去籽，果肉用醫用紗布包裹，擠壓，得到諾麗果汁，果汁再用一次性0.22 μm 濾膜（milipore）進行過濾除菌，備用。

1.1.3藥品和試劑RMPI1640培養液購自北京索萊寶公司；無支原體胎牛血清為杭州四季清生物工程材料有限公司產品；Trypsin為 Amersco 公司產品；DMSO、LDH 脫氫酶試劑盒購自Promega公司；MTT、Hoechst33342/PI細胞凋亡測定試劑盒上海美吉生物醫藥科技有限公司。

1.1.4主要儀器超凈工作臺（蘇凈安泰VS-840K-U，蘇州），二氧化碳培養箱（Thermo/Forma3111，美國），倒置熒光顯微鏡（Zeiss/Axiovert 40CFL，德國），全自動酶標儀（Thermo Multiskan FC，美國）；細胞培養瓶，細胞培養板（康寧）。

1.2方法

1.2.1細胞培養PC12細胞培養用含10%胎牛血清 RMPI 1640 培養液，37 ℃、5% CO2條件下培養，每2 d傳代1次。待細胞增長至80%融合時，用0.25%胰酶消化細胞，調整細胞密度至1 × 105 個/mL 后傳代或接種于細胞培養板進行各項指標測定。

1.2.2細胞形態檢測取對數生長期的PC12細胞接種于96孔培養板中，每孔100 μL。培養24 h后吸棄培養液。試驗分為對照組、損傷組、預防組，每組設3個復孔。對照組細胞按常規方法培養，預防組用終體積分數分別為1%、2.5%、5%的諾麗果汁培養24 h后，吸棄培養液，PBS沖洗1～2次，加入H2O2終濃度為0.3 mmol/L的培養液，培養4 h，損傷組用不含諾麗果汁的培養液培養，其余處理方法與預防組細胞相同，熒光倒置顯微鏡檢查細胞形態。

1.2.3MTT檢測諾麗果汁對氧化應激損傷PC12 細胞活力的影響按照“1. 2 .2”節進行試驗分組、給藥處理及培養，然后用MTT法測定細胞活力，向各孔加入5 g/L的MTT后繼續培養4 h，小心吸棄所有培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO） 振蕩10 min。在酶標儀上以560 nm 波長測定各孔吸光度D。按相對活力=（D處理-D空白）/（D正常平均-D空白） × 100%公式計算細胞相對活力。

1.2.4細胞凋亡和細胞壞死檢測根據Hoechst33342/PI試劑盒說明書進行細胞凋亡和細胞壞死檢測。先配制好染色緩沖液，然后對各處理組進行離心收集懸浮細胞，用PBS洗滌細胞2次。取適量離心收集好的細胞用0.5～1 mL 染色緩沖液將細胞重懸，使其濃度大約為1 ×106 個/mL。加入5 μL Hoechst 33342染色液。 輕輕混勻后室溫避光孵育10～15 min。用PBS洗滌細胞1次，用0.5～1 mL染色緩沖液將細胞重懸，加入5 μ LPI染色液，輕輕混勻后室溫避光孵育10～15 min，再用PBS洗滌細胞1次，加PBS稀釋至適當濃度后熒光顯微鏡檢測結果。Hoechst33342-DNA的最大激發波長為350 nm，最大發射波長為460 nm，PI的最大激發和最大發射波長分別為488、615 nm。

1.2.5LDH檢測諾麗果汁對PC12 細胞的保護作用細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結構的破壞時，細胞內的LDH會釋放到培養基中，而活細胞則不會，所以培養上清中LDH的活性可以反映細胞的死亡或損傷程度。各組細胞經相應處理后，吸取細胞培養上清，按照試劑盒說明書操作檢測LDH含量。

1.2.6數據處理與統計分析采用SAS 9.0統計分析軟件分析試驗數據，處理組之間差異顯著性分析采用鄧肯氏（Duncans）多重比較法，以P<0.05為差異顯著。

2結果

2.1諾麗果汁對PC12細胞形態的影響

本研究發現，對照組細胞呈長梭形或多角形鑲嵌狀排列，細胞邊界清晰，大小均勻，細胞豐滿，無重疊生長現象（圖1-A）。而H2O2損傷組細胞出現收縮、變圓、體積變小，細胞間隙增寬，大部分細胞破碎、脫落，但細胞輪廓尚較清晰（圖1-B）。用不同劑量諾麗果汁預處理后均有不同程度的保護作用，細胞形態好于損傷組（圖1），其中10%諾麗果汁預處理組細胞形態與對照組接近（圖1-E）。

2.2諾麗果汁對H2O2氧化損傷PC12細胞存活率的影響

不同質量濃度諾麗果汁均可減小H2O2對細胞的增殖抑制作用，細胞存活率從120%增加到166%，與H2O2損傷組比，差異極顯著（P<0.01）（圖2）。此結果表明，在一定濃度范圍內，諾麗果汁不僅有保護細胞免受損傷的作用，而且還有促進細胞增殖的作用。

2.3諾麗果汁對H2O2氧化損傷PC12細胞壞死的影響

Hoechst33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，與DNA結合，凋亡細胞有膜通透性改變，主要攝取Hoechst染料，凋亡細胞中的凝聚染色質會比正常細胞中的染色質染色更深、更加明亮，表現為強藍色熒光。壞死細胞由于有很強的PI嗜染性并可覆蓋Hoechest染色，故呈強紅色熒光。本研究發現，對照組有少數 PI染色陽性細胞（橘黃色），300 μmol/L H2O2處理組PI染色陽性細胞顯著增加，而經諾麗果汁預處理后PI陽性細胞完全沒有，但有少量凋亡細胞（亮藍色）（圖3）。以上結果表明，諾麗果汁可顯著地減少H2O2誘導的細胞壞死。

2.4諾麗果汁對H2O2氧化損傷PC12細胞LDH漏出率的影響

研究發現對照組中的LDH含量較低，而模型組中的LDH含量極顯著高于對照組。經諾麗果汁保護后，LDH含量下降，并隨諾麗果汁濃度的增加而顯著降低（（圖4）。結果表明，諾麗果汁有效降低H2O2對PC12細胞的氧化損傷，且在1%～5%的濃度范圍內其保護效果與諾麗果汁濃度呈正相關。

3結論與討論

本研究用H2O2造成PC12神經細胞氧化損傷模型，通過熒光顯微鏡觀察細胞形態，MTT測定細胞存活率、乳酸脫氫酶（LDH）活力檢測法，Ho/PI染色檢測細胞凋亡探討諾麗果汁對過氧化氫所致PC12細胞氧化損傷的影響，發現1%～5%體積分數諾麗果汁均能不同程度地保護細胞形態，增加細胞的生存率，抑制過氧化氫誘導的PC12細胞壞死，減少損傷后LDH的生成，表明1%～5%體積分數諾麗果汁對過氧化氫誘導的PC12細胞損傷有保護作用，這將為諾麗果用于開發神經保護方面的保健品奠定了理論依據。

自1983年Mosmann創立了MTT比色法以來，由于其經濟、靈敏、無放射性污染等特點，使之成為細胞生物學及相關研究領域一種常用的細胞活性檢測方法[12]。本研究采用MTT 比色法分析了1%～5%范圍內諾麗果汁對過氧化氫誘導PC12損傷存活率的影響，發現其不僅有保護細胞免受損傷的作用，而且還有促進細胞增殖的作用，但有研究顯示，10%諾麗果汁能降低Hela細胞（宮頸癌細胞）22.3%的生存率，具有抗癌作用[13]，這表明不同濃度范圍的諾麗果汁對細胞的增殖作用不同。

雖然本研究首次報道了1%～5%體積分數諾麗果汁具有神經保護作用，但是在更大濃度的范圍內，諾麗果汁對過氧化氫誘導的PC12細胞損傷是否還存在保護作用尚不得而

知。此外，1%～5%體積分數諾麗果汁產生的保護作用機制尚不清楚。因此，今后將在更廣的濃度范圍內研究諾麗果汁對PC12細胞的保護作用，并探究其作用機制。

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