生物反應(yīng)器中PRRSV工業(yè)規(guī)模增殖工藝的建立

馮磊++王偉峰++吳培培++褚軒++陳麗++侯繼波

摘要：分析比較了3種不同微載體懸浮培養(yǎng)工藝——分批換液式、消化傳代放大式、循環(huán)灌注培養(yǎng)式對(duì)Marc-145細(xì)胞微載體培養(yǎng)效能及生理代謝的特點(diǎn)及差異，并實(shí)現(xiàn)了從5 L至60 L反應(yīng)器放大過(guò)程的PRRSV實(shí)際增殖應(yīng)用。結(jié)果表明，在5 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器中使用相同的微載體用量6 g/L，分批換液式培養(yǎng)和消化傳代放大式培養(yǎng)僅獲得27×105～28×105 cells/mL的細(xì)胞密度，低于循環(huán)灌注培養(yǎng)式的培養(yǎng)能力（59.4×105 cells/mL）。根據(jù)這3種不同培養(yǎng)工藝的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并實(shí)施了可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的工藝流程，即Marc-145種子細(xì)胞以循環(huán)灌注培養(yǎng)方式在5 L反應(yīng)器中完成初級(jí)培養(yǎng)，經(jīng)消化傳代工藝，將種子細(xì)胞放大接種于60 L反應(yīng)器中進(jìn)行分批換液式的二級(jí)培養(yǎng)，用于PRRSV的大規(guī)模增殖，結(jié)果顯示PRRSV增殖滴度可達(dá)到108.3TCID50/mL。該過(guò)程成功地模擬了Marc-145細(xì)胞在工業(yè)級(jí)水平上的放大培養(yǎng)操作工藝，其放大倍數(shù)達(dá)到1 ∶3的傳代系數(shù)，具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；微載體培養(yǎng)；Marc-145細(xì)胞；循環(huán)灌注培養(yǎng)；分批換液式培養(yǎng)；消化傳代式培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： Q943.1；S858.285.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0247-05

收稿日期：2014-12-26

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：201303046）。

作者簡(jiǎn)介：馮磊（1979—），男，江蘇南通人，博士，副研究員，主要從事獸用生物制品工程技術(shù)研究。E-mail：fenglnt@hotmail.com。

通信作者：侯繼波，研究員。E-mail：houjibo@jaas.ac.cn。豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病（豬藍(lán)耳?。1]?？刂曝i繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的主要辦法是使用疫苗進(jìn)行免疫防控，而提高病毒增殖規(guī)模及滴度是疫苗生產(chǎn)的一個(gè)重要目標(biāo)。目前該疫苗的生產(chǎn)用細(xì)胞株為Marc-145細(xì)胞[2]，具體的生產(chǎn)工藝依然是實(shí)驗(yàn)室滾瓶培養(yǎng)工藝的簡(jiǎn)單數(shù)量放大，其生產(chǎn)規(guī)模、產(chǎn)品質(zhì)量都有待于進(jìn)一步提高。在生物反應(yīng)器中完成細(xì)胞株的懸浮培養(yǎng)及病毒增殖，并按照工業(yè)規(guī)模要求完成規(guī)模放大是亟待解決的難題。

自從1976年van Wezel開(kāi)發(fā)出動(dòng)物細(xì)胞微載體培養(yǎng)技術(shù)[3]，生物制藥領(lǐng)域進(jìn)入了利用體外動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白、抗體、細(xì)胞因子、疫苗等生物技術(shù)藥物的高速發(fā)展時(shí)期[4-5]。到目前為止，微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)已在多種疫苗，如狂犬病疫苗[6]、人流感疫苗[7]、黃熱病毒疫苗[8]等大規(guī)模制備中起到關(guān)鍵性的作用。同時(shí)動(dòng)物細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)也逐步形成了一些獨(dú)特的培養(yǎng)條件、放大工藝及病毒增殖策略，以適用于不同的疫苗制備工藝需求。

本研究以Marc-145細(xì)胞為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室5 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器中考察了分批換液式、消化傳代放大式、循環(huán)灌注式3種不同培養(yǎng)工藝對(duì)該細(xì)胞在微載體（cytodex 1）上生長(zhǎng)及代謝的影響，按照該疫苗工業(yè)生產(chǎn)要求，評(píng)價(jià)并設(shè)計(jì)出不同培養(yǎng)工藝在細(xì)胞培養(yǎng)、病毒增殖過(guò)程中的具體應(yīng)用模式，最終在60 L培養(yǎng)體積中實(shí)現(xiàn)整個(gè)病毒增殖過(guò)程，為我國(guó)PRRS疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及種毒

Marc-145細(xì)胞為國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保藏細(xì)胞株。PRRSV為國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保藏毒種。

1.2材料及設(shè)備

1.2.1微載體cytodex 1購(gòu)自GE公司。用無(wú)Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液清洗并浸泡至少3 h后，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min冷卻后儲(chǔ)于4 ℃密封待用。使用前用37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2遍。

1.2.2試劑細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM購(gòu)自默克密理博清大天一科技有限公司。新生牛血清購(gòu)自Gibco公司。配制成含有5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，其中含有100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，經(jīng)無(wú)菌0.22 μm膜過(guò)濾除菌，4 ℃冷藏備用。胰蛋白酶購(gòu)自Invitrogen公司，用無(wú)Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液配制成0.25%濃度的胰蛋白酶溶液，調(diào)整pH值至7.5～8.0，經(jīng)無(wú)菌0.22 μm膜過(guò)濾除菌，4 ℃冷藏備用。

1.2.3設(shè)備5 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器由華東理工大學(xué)國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心（上海）制造，反應(yīng)器培養(yǎng)體積范圍1.2～4.0 L，具有溶解氧（DO）、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速及四氣（N2、O2、CO2、空氣）控制系統(tǒng)。

60 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器由默克密理博北京清大天一科技有限公司制造，反應(yīng)器培養(yǎng)體積為48 L，具有DO、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速及四氣（N2、O2、CO2、空氣）控制系統(tǒng)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.15 L生物反應(yīng)器中Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)分批換液式操作DO電極、pH電極標(biāo)定及罐體安裝完畢，經(jīng)121 ℃高壓滅菌45min及預(yù)培養(yǎng)1 d（無(wú)菌檢測(cè)）后，用于Marc-145細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)，微載體用量分別為3、6、9 g/L，初始細(xì)胞接種密度均為3×105 cells/mL，培養(yǎng)體積為4 L，利用分批換液式操作，即將培養(yǎng)液、細(xì)胞及微載體一次全部投入進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行換液操作?？刂艱O為50%飽和度，pH值為7.0～7.1，攪拌轉(zhuǎn)速為25～40 r/min，培養(yǎng)溫度為37 ℃。每天從反應(yīng)器中吸取樣品，測(cè)定細(xì)胞密度和培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分濃度、代謝副產(chǎn)物濃度等。

不同培養(yǎng)方式的反應(yīng)器預(yù)備安裝、滅菌流程及過(guò)程參數(shù)的設(shè)定均同上所述，以下不再贅述。

1.3.25 L生物反應(yīng)器中Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)消化傳代放大式操作初始培養(yǎng)時(shí)微載體用量分別2、3 g/L，初始細(xì)胞接種密度為3×105cells/mL，培養(yǎng)體積分別為4 L。經(jīng)過(guò)初始培養(yǎng)后，對(duì)2、3 g/L的微載體培養(yǎng)物進(jìn)行消化操作，使細(xì)胞從微載體上消化脫落，將消化后的細(xì)胞和舊微載體一并分別接種于16 g和12 g新微載體中，進(jìn)行消化傳代后放大再培養(yǎng)，微載體的終濃度均為6 g/L，培養(yǎng)體積均為4 L。每天從反應(yīng)器中吸取樣品，測(cè)定細(xì)胞密度和培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分濃度、代謝副產(chǎn)物濃度等。

1.3.35 L生物反應(yīng)器中Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)循環(huán)灌注式操作微載體用量為6 g/L，初始細(xì)胞接種密度為3.5×105 cells/mL，培養(yǎng)體積為4 L。培養(yǎng)24 h后，開(kāi)始進(jìn)行循環(huán)灌注操作，操作前期進(jìn)行每天1/2個(gè)培養(yǎng)體積的循環(huán)灌注量，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)及細(xì)胞生長(zhǎng)的加快，將循環(huán)灌注的速率逐步提高至每天1～3個(gè)培養(yǎng)體積的循環(huán)灌注量。循環(huán)灌注操作需要安置1個(gè)大體積的貯液罐（貯液量10～12 L），通過(guò)2個(gè)變速蠕動(dòng)泵及硅膠管道將反應(yīng)器和貯液罐閉環(huán)連接，形成培養(yǎng)液以一定流速?gòu)馁A液罐中泵入反應(yīng)器的同時(shí)，培養(yǎng)液以相同的流速?gòu)姆磻?yīng)器中泵回貯液罐。每天分別從反應(yīng)器和貯液罐中吸取樣品，測(cè)定細(xì)胞密度和培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分濃度、代謝副產(chǎn)物濃度等。

通過(guò)上述3種操作方式，在5 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器中最終實(shí)現(xiàn)的都是在6 g/L微載體用量下進(jìn)行Marc-145細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)，比較不同操作方式的培養(yǎng)效能。

1.3.4消化后Marc-145細(xì)胞在60 L生物反應(yīng)器中微載體懸浮培養(yǎng)操作及PRRSV接毒增殖操作經(jīng)消化處理后的Marc-145細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞活率，按照初始細(xì)胞密度3.0×105 cells/mL 重新接種于新微載體中，微載體的使用濃度為 3 g/L，培養(yǎng)體積為48 L。設(shè)置細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程pH值、DO及溫度為自動(dòng)控制。培養(yǎng)過(guò)程中每天檢測(cè)細(xì)胞密度、營(yíng)養(yǎng)物濃度及代謝副產(chǎn)物的濃度。視培養(yǎng)的具體情況選擇換液或其他操作輔助細(xì)胞生長(zhǎng)。

待細(xì)胞密度增長(zhǎng)至2×106～3×106 cells/mL進(jìn)行接毒操作，PRRS種毒以MOI=0.05接入微載體懸浮培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞的60 L反應(yīng)器中[9]，接毒后24、48、72 h取樣測(cè)定PRRSV的效價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的分批換液式操作

一次性將細(xì)胞和微載體投入反應(yīng)器進(jìn)行懸浮培養(yǎng)是一種常用的簡(jiǎn)單培養(yǎng)方式，增加微載體的用量即可增加細(xì)胞生長(zhǎng)表面，進(jìn)而收獲更多的細(xì)胞，但試驗(yàn)結(jié)果表明，采用相同的初始細(xì)胞密度3.0×105cells/mL進(jìn)行Marc-145細(xì)胞接種培養(yǎng)，微載體的濃度直接影響最終的培養(yǎng)效果（圖1）。3 g/L的微載體用量可獲得較好的細(xì)胞生長(zhǎng)效果，培養(yǎng)3 d通過(guò)換液操作使得Marc-145細(xì)胞在培養(yǎng)6 d獲得最大活細(xì)胞密度23.8×105 cells/mL。而9 g/L的微載體用量條件下細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)，雖然其提供了最大的細(xì)胞生長(zhǎng)表面，但3.0×105 cells/mL 的初始接種密度過(guò)低，分配在每個(gè)微載體上的初始細(xì)胞個(gè)數(shù)太少，細(xì)胞生長(zhǎng)的延遲期維持了3 d之久，雖然在培養(yǎng)3、6 d進(jìn)行了2次換液操作，細(xì)胞仍然生長(zhǎng)緩慢。此外 9 g/L 的微載體濃度使得細(xì)胞培養(yǎng)液的流動(dòng)性變差，氣體及熱量的傳遞無(wú)法按照牛頓流體的線性控制完成，影響了最終的培養(yǎng)效果，同時(shí)也說(shuō)明該生物反應(yīng)器的最大混合能力不能支持動(dòng)物細(xì)胞在9 g/L的微載體使用濃度上進(jìn)行生長(zhǎng)。通過(guò)2次換液操作，6 g/L微載體在3.0×105 cells/mL的初始接種密度下，可以達(dá)到27.2×105 cells/mL的最大活細(xì)胞密度；但通過(guò)顯微觀察，微載體表面依然有較多的空隙，并沒(méi)有達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)的最大效能，這可能就是分批換液式培養(yǎng)工藝的局限性。

2.2Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的消化傳代放大式操作

Marc-145細(xì)胞分別在2 g/L和3 g/L的微載體濃度下

進(jìn)行初始培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后3、4 d通過(guò)胰酶消化作用，使得細(xì)胞從微載體上脫落，形成細(xì)胞與微載體的混懸液。該混合物再重新接種于16 g和12 g新微載體中，培養(yǎng)體積均為4 L，進(jìn)行消化傳代后放大再培養(yǎng)，結(jié)果如圖 2所示。該試驗(yàn)的實(shí)際目的就是利用消化傳代的方式將Marc-145細(xì)胞最終接種在6 g/L的微載體用量上進(jìn)行培養(yǎng)（便于在整個(gè)研究中作比較），放大比例分別為1 ∶3和1 ∶2。結(jié)果表明，Marc-145細(xì)胞在經(jīng)過(guò)消化操作后，細(xì)胞活力有不同程度的損傷，活細(xì)胞密度降低，直接影響了細(xì)胞的重新爬球，使得細(xì)胞重新爬球后再生長(zhǎng)的延遲期時(shí)間延長(zhǎng)，最終最大活細(xì)胞密度在2個(gè)放大比例組別中沒(méi)有明顯差異，在28×105 cells/mL 左右。該試驗(yàn)說(shuō)明，利用胰酶消化可以進(jìn)行微載體培養(yǎng)的傳代放大，但其消化工藝需要進(jìn)行優(yōu)化，盡量避免細(xì)胞經(jīng)消化后的活力損傷，影響放大再爬球生長(zhǎng)的效果。

2.3Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的循環(huán)灌注式操作

利用循環(huán)灌注的培養(yǎng)方式進(jìn)行Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)前面試驗(yàn)的結(jié)果，適度提高初始接種細(xì)胞密度達(dá)到3.5×105 cells/mL，微載體用量為6 g/L（便于在整個(gè)研究中作比較），同時(shí)在培養(yǎng)1 d后開(kāi)始進(jìn)行連續(xù)循環(huán)灌注操作，灌注速率為0.5個(gè)培養(yǎng)體積/d，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，灌注速率逐步在培養(yǎng)2～4 d提高到1.0～1.5個(gè)培養(yǎng)體積/d，在培養(yǎng)4～7 d提高到1.5～3.0個(gè)培養(yǎng)體積/d。通過(guò)這種方式，Marc-145細(xì)胞獲得比較好的培養(yǎng)效果，細(xì)胞進(jìn)入快速生長(zhǎng)的時(shí)間縮短，培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有頻繁的罐上操作，利用變速蠕動(dòng)泵將培養(yǎng)上清進(jìn)行連續(xù)的密閉循環(huán)流動(dòng)，為細(xì)胞提供相對(duì)較好的生長(zhǎng)環(huán)境，培養(yǎng)6～7 d活細(xì)胞密度達(dá)到59.4×105 cells/mL，觀察微載體生長(zhǎng)表面基本都被細(xì)胞所覆蓋，細(xì)胞層生長(zhǎng)致密并維持較高的存活率。

2.43種培養(yǎng)方式條件下Marc-145細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)、生理代謝的比較

3種培養(yǎng)方式對(duì)Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的生

長(zhǎng)、生理代謝產(chǎn)生不同結(jié)果（表1）。細(xì)胞在微載體上展開(kāi)生長(zhǎng)的延遲期長(zhǎng)短與初始接種密度和微載體用量的比例有關(guān)，3.0×105 cells/mL的初始細(xì)胞密度對(duì)于3 g/L的微載體用量來(lái)說(shuō)是比較適合的，表現(xiàn)為大致13 h的延遲期，提高微載體用量會(huì)造成延遲期的延長(zhǎng)。如果適當(dāng)提高初始細(xì)胞密度到3.5×105 cells/mL，在6 g/L微載體用量下也可獲得較快的初始生長(zhǎng)。

循環(huán)灌注培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞平均倍增時(shí)間明顯小于其他2種培養(yǎng)方式，大致為13 h。同時(shí)培養(yǎng)周期也僅為最少的6～7 d，即可獲得最大的細(xì)胞密度59.4×105 cells/mL，平均比生長(zhǎng)速率0.479 d-1，高于其他組別。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，考察培養(yǎng)液滲透壓的變化，結(jié)果表明，在經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的利用，雖然營(yíng)養(yǎng)成分還沒(méi)有利用完，換液前或傳代前的培養(yǎng)液滲透壓已經(jīng)達(dá)到或接近400 mOsm/kg，這樣的滲透壓對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)極為有害，這可能是分批換液培養(yǎng)和消化傳代放大培養(yǎng)不能獲得高密度培養(yǎng)的原因之一。而直到循環(huán)灌注培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)液的滲透壓才達(dá)到391.5 mOsm/kg，因?yàn)槔醚h(huán)灌注及時(shí)稀釋了細(xì)胞代謝出的副產(chǎn)物（乳酸和氨），同時(shí)也減少了培養(yǎng)過(guò)程中為了維持培養(yǎng)pH值而進(jìn)行的補(bǔ)堿用量（NaHCO3），為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了相對(duì)較好的培養(yǎng)環(huán)境。

循環(huán)灌注培養(yǎng)為Marc-145細(xì)胞微載體懸浮生長(zhǎng)提供了較好的培養(yǎng)環(huán)境，使得細(xì)胞生長(zhǎng)代謝較為旺盛。測(cè)定各組別細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物和代謝副產(chǎn)物濃度，發(fā)現(xiàn)循環(huán)灌注培養(yǎng)的 Marc-145細(xì)胞對(duì)葡萄糖和谷氨酰胺的利用率高于其他組別，表現(xiàn)為葡萄糖比消化速率為2.065 mmol/（109 cells·d），谷氨酰胺比消耗速率為0.174 mmol/（109 cells·d），均高于其他組別，同時(shí)乳酸對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)為1.228 mmol/mmol，低于其他組別，說(shuō)明Marc-145細(xì)胞在循環(huán)灌注培養(yǎng)過(guò)程中能夠充分利用營(yíng)養(yǎng)物，同時(shí)其代謝副產(chǎn)物乳酸的生成較少，葡萄糖代謝途徑部分減弱了乳酸生成的通量，而轉(zhuǎn)向用于生理代謝和細(xì)胞生物量的增加，進(jìn)而表現(xiàn)為細(xì)胞對(duì)葡萄糖和谷氨酰胺的得率系數(shù)提高，分別達(dá)到0.081×109 cells/mmol和 0.958×109 cells/mmol，均高于其他組別。

2.5Marc-145細(xì)胞微載體一級(jí)、二級(jí)懸浮培養(yǎng)及PRRSV接毒增殖全過(guò)程

根據(jù)上述研究結(jié)果，設(shè)計(jì)出Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)、消化傳代放大、PRRSV接毒增殖的全過(guò)程：（1）Marc-145細(xì)胞凍存細(xì)胞復(fù)蘇之后，經(jīng)2～3代的滾瓶擴(kuò)增，接種至5 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器，提高微載體的用量為6 g/L，采用循環(huán)灌注的培養(yǎng)方式進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，在短時(shí)間內(nèi)獲得高密度的Marc-145細(xì)表13種培養(yǎng)方式條件下Marc-145細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)、生理代謝的比較

項(xiàng)目Marc-145細(xì)胞不同培養(yǎng)模式分批換液培養(yǎng)消化傳代放大培養(yǎng)循環(huán)灌注培養(yǎng)3 g/L6 g/L2～6 g/L3～6 g/L6 g/L延遲期持續(xù)時(shí)間（h）131822（消化后）22（消化后）16平均倍增時(shí)間（h）1821212013接種細(xì)胞密度（×105 cells/mL）3.03.03.03.03.5最大細(xì)胞密度（×105 cells/mL）23.8±1.227.2±1.127.2±1.128.7±1.259.4±1.8細(xì)胞平均比生長(zhǎng)速率（d-1）0.346±0.0140.312±0.0110.271±0.0120.284±0.0090.479±0.008培養(yǎng)周期（d）6～77～88～98～96～7培養(yǎng)液總量（L）812121216滲透壓（mOsm/kg）換液前或傳代前413.8387.3390.1395.4培養(yǎng)結(jié)束400.7409.4401.1405.8391.5葡萄糖比消耗速率[mmol/（109 cells·d）]1.791±0.0021.885±0.0061.872±0.0051.891±0.0072.065±0.005谷氨酰胺比消耗速率[mmol/（109 cells·d）]0.157±0.000 50.143±0.000 50.142±0.000 60.159±0.000 50.174±0.000 6乳酸比生成速率[mmol/（109 cells·d）]2.474±0.0042.628±0.0032.580±0.0052.619±0.0092.536±0.004氨比生成速率[mmol/（109 cells·d）]0.116±0.0020.115±0.0010.105±0.0010.118±0.0030.078±0.001乳酸對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)（mmol/mmol）1.381±0.0021.394±0.0031.378±0.0021.385±0.0021.228±0.001細(xì)胞對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)（×109 cells/mmol）0.079±0.0010.076±0.0020.067±0.0020.066±0.0040.081±0.003細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的得率系數(shù)（×109 cells/mmol）0.909±0.0010.874±0.0020.880±0.0020.789±0.0020.958±0.003

胞種子細(xì)胞，達(dá)到50×105 cells/mL，并保持較高的細(xì)胞存活率。（2）采用消化傳代操作工藝，使得種子細(xì)胞從舊微載體上脫落、分散，直接接入60 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器中，與新微載體及新鮮培養(yǎng)液混合均勻，完成消化放大過(guò)程。整個(gè)消化及轉(zhuǎn)移放大過(guò)程在30 min內(nèi)完成。（3）在60 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器中，微載體用量為3 g/L，培養(yǎng)體積為45～50 L，采用分批式培養(yǎng)方式，根據(jù)細(xì)胞實(shí)際生長(zhǎng)情況，適度更換培養(yǎng)液可完成Marc-145細(xì)胞的60 L反應(yīng)器二級(jí)微載體懸浮培養(yǎng)過(guò)程，細(xì)胞密度達(dá)到25×105～30×105 cells/mL即可進(jìn)行PRRSV接毒操作。以MOI=0.05進(jìn)行PRRSV接毒，完成PRRSV的增殖過(guò)程，在接毒后2 d收毒，獲得最大增殖毒價(jià)為108.3 TCID50/mL（圖4）。整個(gè)5 L→60 L Marc-145細(xì)胞放大培養(yǎng)及PRRS病毒增殖過(guò)程控制在12 d左右，生產(chǎn)周期較短，操作簡(jiǎn)單。接毒前和接毒后細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)形態(tài)如圖5所示。

3討論

動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)，其貼壁型生長(zhǎng)特性沒(méi)有改變，所以在分批式培養(yǎng)中提高微載體的用量，供應(yīng)更大的細(xì)胞生長(zhǎng)表面，即可獲得更高的細(xì)胞密度。但對(duì)于類似Marc-145細(xì)胞這樣對(duì)初始細(xì)胞密度有一定依賴性的細(xì)胞，過(guò)度提高微載體用量會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法正常啟動(dòng)生長(zhǎng)，使得細(xì)胞生長(zhǎng)的延遲期大大延長(zhǎng)，培養(yǎng)周期也隨之延長(zhǎng)，在培養(yǎng)后期無(wú)法獲

得較好的培養(yǎng)效果。此外，每臺(tái)攪拌式生物反應(yīng)器的混合供氧效能是基本一定的，即在細(xì)胞能夠忍受的最大攪拌和通氣條件下，其攪拌混合微載體培養(yǎng)物的能力是一定的，盲目提高微載體的用量會(huì)使得培養(yǎng)環(huán)境中攪拌混合的效果變差，直接導(dǎo)致傳氧、傳質(zhì)的效果變差，細(xì)胞無(wú)法正常生長(zhǎng)。所以選用適宜的微載體用量及與之相匹配的細(xì)胞初始接種密度，可以獲得較好的培養(yǎng)效果，同時(shí)也縮短培養(yǎng)周期。

消化傳代放大培養(yǎng)方式模擬了工業(yè)生產(chǎn)中細(xì)胞培養(yǎng)放大再培養(yǎng)的過(guò)程，如何讓細(xì)胞從舊微載體表面有效脫落，并保持再次“爬球生長(zhǎng)”的能力，進(jìn)一步在新微載體上黏附生長(zhǎng)是微載體培養(yǎng)工程放大的難點(diǎn)[10]。文獻(xiàn)表明，利用“球到球”的傳代方式，細(xì)胞不通過(guò)消化脫落，而是直接讓細(xì)胞從舊微載體以“細(xì)胞橋”的方式向新微載體上轉(zhuǎn)移[11]，雖然可以有部分細(xì)胞能夠完成此種放大過(guò)程，但其放大效率不高，放大比率有限，一般是1 ∶1或1 ∶2進(jìn)行放大[12]，同時(shí)也造成較高的“空球率”，培養(yǎng)效果不佳，浪費(fèi)培養(yǎng)資源[13]。采用胰酶消化的方式，將細(xì)胞從微載體上消化下來(lái)后，再與新微載體混合重新黏附，可以使得傳代后的細(xì)胞均勻黏附于新微載體表面，充分利用生長(zhǎng)空間，可獲得較好的培養(yǎng)效果。

循環(huán)灌注培養(yǎng)方式是傳統(tǒng)灌注培養(yǎng)方式的一種優(yōu)化方式[14]。傳統(tǒng)的灌注培養(yǎng)方式是指在新鮮培養(yǎng)液流入的同時(shí)，用過(guò)的培養(yǎng)液以相同的速度流出。該方式雖然可以獲得不錯(cuò)的培養(yǎng)效果，但存在諸多弊端，如新鮮培養(yǎng)液的利用率不高，細(xì)胞在沒(méi)有完全利用完培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)可能已經(jīng)被抽離出反應(yīng)器造成浪費(fèi)；培養(yǎng)液預(yù)備量較大的同時(shí)，廢液處理量也較大，通常在傳統(tǒng)灌注培養(yǎng)周期內(nèi)會(huì)造成10～20倍培養(yǎng)體積的液體處理量[15]。而循環(huán)灌注方式完全克服了傳統(tǒng)灌注方式的缺點(diǎn)，灌注量?jī)H為培養(yǎng)體積的3倍，通過(guò)控制灌注液的灌注速率配合細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，供應(yīng)充足的營(yíng)養(yǎng)，并有效稀釋代謝副產(chǎn)物的濃度，細(xì)胞的培養(yǎng)效果在本研究3種培養(yǎng)工藝中是最好的。

根據(jù)本研究中3種培養(yǎng)方式的特點(diǎn)及從5 L反應(yīng)器至 60 L 反應(yīng)器規(guī)模放大的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果，可以設(shè)計(jì)出如下工藝流程：（1）Marc-145細(xì)胞的種子培養(yǎng)可以在小規(guī)模的生物反應(yīng)器（15～30 L）中進(jìn)行高微載體用量的循環(huán)灌注培養(yǎng)，充分利用微載體的生長(zhǎng)表面，在較短的時(shí)間內(nèi)能夠獲得最多的種子細(xì)胞，為放大培養(yǎng)規(guī)模提供細(xì)胞準(zhǔn)備。（2）利用胰酶消化傳代工藝進(jìn)行種子細(xì)胞的傳代放大，通過(guò)至少1 ∶3的放大比例將種子接種于60～120 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器中進(jìn)行再培養(yǎng)。（3）在傳代放大后，控制Marc-145細(xì)胞的接種細(xì)胞密度，維持細(xì)胞與微載體之間合適的接觸比例，采用分批換液的培養(yǎng)方式，簡(jiǎn)化反應(yīng)罐上操作及所需設(shè)備，使得細(xì)胞均勻分布在微載體表面，迅速生長(zhǎng)，達(dá)到接毒要求，進(jìn)行病毒增殖。上述流程已在該疫苗生產(chǎn)企業(yè)得到實(shí)際應(yīng)用，企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程數(shù)據(jù)未標(biāo)出。

綜上所述，本研究比較了3種培養(yǎng)方式對(duì)Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的實(shí)際效能，由此制定并實(shí)施可能的應(yīng)用流程，為我國(guó)PRRS疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了研究基礎(chǔ)。

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