櫻桃谷肉鴨大腸桿菌病PCR鑒定及治療藥物篩選與應(yīng)用

黃銀云++胡新崗++郭廣富++徐婷婷

摘要：為給如皋地區(qū)養(yǎng)鴨合作社肉鴨養(yǎng)殖診治大腸桿菌病提供依據(jù)，采用PCR技術(shù)鑒定長期困擾養(yǎng)鴨業(yè)疑似大腸桿菌病的病原，通過27種藥敏制片試驗(yàn)篩選出適合當(dāng)?shù)氐南蠕h霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B等6種高敏藥物及頭孢哌酮、頭孢曲松、羧芐西林、氨芐西林等4種中敏藥物，確定鏈霉素、卡那霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、氧氟沙星等17種抗菌藥物不適于在該地區(qū)應(yīng)用。并采用6種高敏藥物分組，治療病鴨均取得了良好的臨床療效。

關(guān)鍵詞：櫻桃谷鴨；大腸桿菌病；PCR；藥敏試驗(yàn)；療效

中圖分類號(hào)： S858.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0241-03

收稿日期：2015-03-22

基金項(xiàng)目：江蘇省高校“青藍(lán)工程”資助。

作者簡(jiǎn)介：黃銀云（1977—），女，江蘇泰州人，碩士，副教授，主要從事動(dòng)物疫病防控研究及動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)教學(xué)工作。E-mail：gxh008@qq.com。隨著集約化養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，大腸桿菌病已嚴(yán)重威脅到養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。大腸桿菌屬于條件性致病菌，當(dāng)由于各種應(yīng)激刺激造成鴨體的免疫功能降低時(shí)，鴨群就會(huì)發(fā)生感染[1]。該病既可通過消化道感染，也可通過呼吸道感染，甚至可以通過種蛋垂直傳播。肉鴨發(fā)病多見于10～30日齡，發(fā)病率和死亡率較高，臨床常見肝周炎、氣囊炎、心包炎和腦炎病變[1-2]。常見的發(fā)病原因包括鴨舍環(huán)境衛(wèi)生差、空氣污濁灰塵多、不重視消毒預(yù)防、引進(jìn)帶有大腸桿菌的鴨苗等。此外，由于養(yǎng)殖戶缺乏科學(xué)給藥知識(shí)，臨床上頻繁使用某些抗菌藥物，導(dǎo)致地方性大腸桿菌耐藥嚴(yán)重，治療效果不佳，而抗菌藥物雖然可以暫時(shí)控制疫情發(fā)展，但停藥后常會(huì)復(fù)發(fā)，給鴨場(chǎng)造成了極大的損失[3]。江蘇省如皋市某櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖合作社長期受疑似大腸桿菌病困擾，筆者應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定該病病原，并通過藥敏試驗(yàn)篩選了該合作社可用的敏感藥物，并取得了很好的臨床效果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器設(shè)備Mikro200R冷凍高速離心機(jī)、JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀、PCR儀（PTC-200rev）、DYY-7C型電泳儀、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳槽、恒溫箱、微量移液器等。

1.1.2試劑麥康凱平板、伊紅美蘭平板、鮮血平板培養(yǎng)基，由江蘇省動(dòng)物流行病學(xué)研究中心制備提供；TSB培養(yǎng)基、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2、10×PCR buffer、100 bp DNALadder和6× DNA 凝膠載入染料（LoadingDye），均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.1病料選取如皋市某櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖合作社疑似感染大腸桿菌新鮮病死鴨10羽，無菌采集肝臟、脾臟、心臟和大腦，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2藥敏試紙先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢氨芐、頭孢他啶、紅霉素、麥迪霉素、美滿霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、萬古霉素、多黏菌素B、氧氟沙星、羧芐西林、哌拉西林、氨芐西林、鏈霉素、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、慶大霉素、克林霉素、四環(huán)素、桿菌肽共計(jì)27種藥敏紙片，購于杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)鴨為如皋市某養(yǎng)鴨合作社發(fā)生大腸桿菌病的600羽20日齡櫻桃谷鴨。試驗(yàn)于2014年5月4日至6月9日進(jìn)行，試驗(yàn)期間均按照該養(yǎng)鴨合作社的常規(guī)飼養(yǎng)管理辦法進(jìn)行日常飼養(yǎng)與管理，重視帶鴨消毒。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離及TSB培養(yǎng)基增菌無菌劃線分離，將病料接種于鮮血平板培養(yǎng)基，置于37 ℃燭缸中培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血情況。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢后，挑取目的菌落，利用TSB培養(yǎng)基增菌。同時(shí)接種于麥康凱、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其生長特性。

1.2.2細(xì)菌DNA的提取細(xì)菌DNA提取采用熱裂解法[4]。

1.2.3PCR檢測(cè)細(xì)菌引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[5]。以提取的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用50 μL反應(yīng)體系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、上下游引物各1 μL、3 μL cDNA、Taq DNA聚合酶 1 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結(jié)果。

1.2.4藥敏試驗(yàn)將經(jīng)過分離純培養(yǎng)的菌株按KB紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[6]，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，分別測(cè)量藥敏紙片的抑菌圈直徑的大小，結(jié)果按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)判斷（表1）。

1.2.5治療設(shè)計(jì)將600羽病鴨隨機(jī)分成6組，每組100羽。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇藥物敏感性較好的6種藥物進(jìn)行治療，對(duì)應(yīng)的組別分別是先鋒霉素Ⅴ組、先鋒霉素Ⅵ組、頭孢呋辛組、丁胺卡那霉素組、紅霉素組、多黏菌素B組。治愈判定標(biāo)準(zhǔn)：臨床癥狀基本消失，精神、飲食、糞便正常。觀察療效，統(tǒng)計(jì)治愈率，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各組間療效差異顯著性。

2結(jié)果

2.1分離菌株的培養(yǎng)特性

目的菌為革蘭氏染色陰性短小桿菌。鮮血平板培養(yǎng)的菌落灰白色，呈凸起圓形，光滑而濕潤，無溶血；在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色菌落；伊紅美藍(lán)平板上形成的菌落呈黑色且有金屬光澤。

2.2PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到大腸桿菌OmpA目的基因片段，片段大小為408 bp（圖1），與預(yù)期的結(jié)果相符。確診該養(yǎng)殖合作社肉鴨感染大腸桿菌病。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表1。在本試驗(yàn)病料采集地，鴨源大腸桿菌對(duì)先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B等6種試驗(yàn)藥物高敏，對(duì)頭孢哌酮、頭孢曲松、羧芐西林、氨芐西林等4種試驗(yàn)藥物中敏，而對(duì)其他試驗(yàn)藥物耐藥。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，高敏藥物和中敏藥物均可用于該群病鴨的治療，以高敏藥物為佳。

2.4治療效果

由藥物治療試驗(yàn)結(jié)果（表2），采用經(jīng)藥敏試驗(yàn)選取的治療藥物，臨床均能及時(shí)控制疫情并取得了較理想的治療效果。先鋒霉素類的先鋒霉素Ⅴ組、先鋒霉素Ⅵ組、頭孢呋辛組之間治療效果差異不顯著（P>0.05）；丁胺卡那霉素組與先鋒霉素類組比較差異不顯著（P>0.05）；紅霉素組與多黏菌素B組比較，差異顯著（P<0.05），這2組與先鋒霉素類組間比較差異亦顯著（P<0.05）。

3分析與討論

研究表明，鴨病原性大腸桿菌血清型復(fù)雜，不同地區(qū)的血清型存在差異[7]。此外，鴨大腸桿菌病與鴨疫里默氏桿菌病都是危害肉鴨養(yǎng)鴨業(yè)最重要的傳染病，2種病的臨床表現(xiàn)極為相似，診斷時(shí)容易混淆。這些都導(dǎo)致大腸桿菌病采用病原學(xué)診斷具有一定的困難。而PCR診斷具有方便、快捷、特異性強(qiáng)、診斷結(jié)果準(zhǔn)的特點(diǎn)，為鴨大腸桿菌病的快速診斷、及時(shí)處理提供了準(zhǔn)確可靠的依據(jù)[5]。

在如皋地區(qū)，肉鴨源大腸桿菌對(duì)先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B最為敏感，可能與這些藥物在該地區(qū)臨床應(yīng)用頻度小有關(guān)。頭孢氨芐、頭孢他啶 、鏈霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素等藥物可能由于廣泛而長期應(yīng)用，導(dǎo)致其耐藥性也較為嚴(yán)重。本次藥敏試驗(yàn)也表明，鴨源大腸桿菌的多重耐藥性還是比較嚴(yán)重的，應(yīng)給予足夠重視。這也提醒養(yǎng)殖戶一旦發(fā)現(xiàn)疫情，應(yīng)立即向畜牧獸醫(yī)部門求助，及時(shí)通過藥敏試驗(yàn)選取有效治療藥物，以免錯(cuò)誤用藥貽誤最佳治療時(shí)機(jī)。在用藥時(shí)要注意輪換、聯(lián)合、交叉用藥，盡量不給細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)會(huì)。

大腸桿菌作為條件性致病菌，對(duì)污染的環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，不重視鴨舍環(huán)境衛(wèi)生，不進(jìn)行鴨舍場(chǎng)地消毒，是該養(yǎng)鴨合作社肉鴨養(yǎng)殖中連續(xù)多批次發(fā)病的主要誘因。因此，實(shí)行引進(jìn)鴨苗檢疫、執(zhí)行全進(jìn)全出制度、嚴(yán)格遵守獸醫(yī)衛(wèi)生防疫制度、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、減少應(yīng)激因素是養(yǎng)鴨業(yè)預(yù)防鴨大腸桿菌病的有效措施。

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