1株不動桿菌發酵液對水稻紋枯病菌的抑菌作用

袁夢思++李建文++劉夢華++孫文秀

摘要：測定了1株不動桿菌A2發酵液對水稻紋枯病菌的抑菌率、菌絲的生長及菌核萌發和形成時間的影響。結果表明，不動桿菌A2發酵液對水稻紋枯病菌具有一定的抑制作用，抑制率達82.6%；導致病原菌菌絲畸形，原生質外漏；經不動桿菌A2處理后降低了菌核的萌發指數，菌核萌發指數為38.2%；明顯延遲了菌核的形成時間。

關鍵詞：不動桿菌；發酵液；水稻紋枯病；病菌；抑菌作用

中圖分類號： S435.111.4+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0164-02

收稿日期：2015-03-27

基金項目：湖北省協同創新中心開放基金（編號：2015MS021）。

作者簡介：袁夢思（1989—），男，湖北黃岡人，碩士研究生，研究方向為細胞生物學。E-mail：YMS20151001@163.com。

通信作者：孫文秀，博士，副教授，主要從事植物病害的生物防治。E-mail：wenxiusun@163.com。水稻紋枯病是一種世界范圍內的土傳真菌病害，為水稻三大病害之一，給水稻的生產造成了巨大經濟損失。水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起，該病原菌寄主范圍廣，致病力強，引起紋枯、立枯等癥狀。與傳統的化學防治、農業防治等方法相比，利用微生物及其代謝產物來防治水稻紋枯病具有高效、安全、低毒、殘留少、不產生抗藥性等優點。迄今為止，發現了包括木霉菌屬[1-2]、青霉菌屬[3]、內生真菌[4]、芽孢桿菌屬[5]、假單胞菌屬[6]、內生細菌[7]及鏈霉菌屬[8-9]等微生物，對水稻紋枯病具有較好的防治效果。尋找新型微生物源農藥防治植物病害具有很大的應用前景，因而篩選更高抑菌活性的微生物對水稻紋枯病的防治有著重要的實踐意義。本研究探討了從土壤中分離到的1株不動桿菌（Acinetobacter sp.）A2對水稻紋枯病菌的抑制作用，為明確該菌的發酵液對水稻紋枯病的防治應用價值和今后開發安全的新型生物農藥提供理論基礎和科學依據。

1材料與方法

1.1供試菌株

不動桿菌A2分離自湖北地區芝麻田土壤；水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）由長江大學微生物實驗室分離提供。

1.2培養基

水稻紋枯病菌培養用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）；不動桿菌A2發酵用牛肉膏蛋白胨固體培養基（NA）和牛肉膏蛋白胨培養液（NB）。

1.3不動桿菌發酵液的制備

采用搖瓶發酵培養法。將不動桿菌A2在NA培養基上劃線后，挑取單菌落于5 mL NB液體培養基中，28 ℃，120 r/min，過夜培養。取菌液1 mL接入裝有50 mL NB培養液的250 mL三角瓶中，振蕩培養48 h（28 ℃，120 r/min）。將不動桿菌A2發酵液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取上清液用細菌過濾器（濾膜孔徑0.22 μm）除菌，即得無菌濾液，4 ℃保存備用。

1.4不動桿菌發酵液對水稻紋枯病菌的抑制作用

取1 mL不動桿菌A2無菌濾液與20 mL PDA培養基混勻，倒入培養皿，制備平板。將直徑為5 mm的水稻紋枯病菌菌塊接種于平板中央，28 ℃培養72 h，以不加無菌濾液的培養基培養的水稻紋枯病菌為對照。此外，將100 μL不動桿菌A2的菌液涂布于PDA平板，再接種水稻紋枯病菌菌塊培養。采用垂直十字法測量菌落直徑，按如下公式計算抑菌率：

抑菌率=對照菌落半徑-處理菌落半徑對照菌落半徑×100%。

1.5不動桿菌發酵液對水稻紋枯病菌菌絲的抑制作用

將水稻紋枯病菌接種在PDA液體培養基中，28 ℃、90 r/min 培養48 h，挑取菌絲球于無菌培養皿中，用不動桿菌A2的發酵液處理24 h，取菌絲做玻片，在倒置顯微鏡下觀察，以無菌水處理為對照，每處理重復3次。

1.6不動桿菌發酵液對水稻紋枯病菌菌核的影響

把滅菌的PDA培養基滴于無菌載玻片上，使之成一薄層，取出放在無菌培養皿內并保濕。將大小相同的水稻紋枯病菌菌核放入不動桿菌A2發酵液中處理1 h后取出，放在載玻片上，每張3粒，28 ℃培養箱中培養24 h，觀察菌核的萌發情況。無菌水處理為對照，每處理重復3次。菌絲萌發指數測定參考于艷敏等的方法[10]。

將同齡、直徑為5 mm的水稻紋枯病菌菌塊接種于含有不動桿菌A2無菌濾液的PDA培養上，28 ℃培養，記錄菌核形成的時間。以PDA培養基培養的水稻紋枯病菌為對照。

2結果與分析

2.1不動桿菌A2對水稻紋枯病菌的抑制作用

測定結果表明，不動桿菌A2無菌濾液對水稻紋枯病菌具有一定的抑制作用，抑制率達82.6%；而A2菌液對水稻紋枯病菌的抑制率則為59.5%，表明不動桿菌A2的抑菌成分主要存在于無菌濾液中（表1）。采用倒置顯微鏡觀察A2無菌濾液處理后的水稻紋枯病菌菌絲，發現菌絲彎曲，頂端膨大，原生質外滲（圖1-a）；而正常的水稻紋枯病菌菌絲細長，原生質均勻，節間距大（圖1-b）。由此可見，不動桿菌A2對

水稻紋枯病菌具有明顯的抑制作用。

2.2不動桿菌A2對水稻紋枯病菌菌核的影響

在光學顯微鏡下觀察發現，用不動桿菌A2發酵液處理水稻紋枯病菌菌核后，菌核都能萌發，菌絲萌發指數為 38.2%，而用無菌水處理后的菌核菌絲萌發指數是76.7%，表明不動桿菌A2對水稻紋枯病菌的菌核萌發具有明顯的抑制作用。此外，在含有不動桿菌A2無菌濾液的培養基上，水稻紋枯病菌菌核形成的時間大大延長，比對照延遲了近72 h（表2）。

3討論

水稻紋枯病是典型的土傳真菌病害，以菌核形式越冬并作為來年病害發生的侵染源，給病害的有效防治造成了很大困難。目前，主要采用井岡霉素等化學藥劑防治水稻紋枯病，但長期單一使用井岡霉素導致水稻紋枯病菌易產生抗藥性，且嚴重污染環境。因此，有必要采取生物防治的措施來控制水稻紋枯病的發生，尋找新型的微生物資源也成為一種必然。在前期的研究中，從湖北地區的芝麻田土壤中分離到了幾株不動桿菌，并發現其對水稻紋枯病菌具有一定的拮抗作用。

不動桿菌廣泛分布于外界環境中，主要存在于水體和土壤中，是一類不發酵糖類、氧化酶陰性的革蘭氏陰性菌。利用不動桿菌的代謝產物進行植物病害防治，與此相關的研究報道較少[11-12]。藺經等[13-14]曾采用從樟樹中分離的鮑曼不動桿菌對梨樹的主要病害進行了防治，發現其發酵液鮑曼菌素能夠抑制梨黑斑病、輪紋病和炭疽病等真菌性病害，起到了較好的防治作用。本試驗結果表明，不動桿菌A2的發酵液能夠有效抑制水稻紋枯病菌的生長，造成菌絲的畸形，降低菌核的萌發指數，延遲菌核的形成時間，達到了一定的抑菌效果。所以在此基礎上，有必要深入研究不動桿菌A2的作用機制，明確其在田間的防治效果，為研制推廣新的生防制劑及有效防治水稻紋枯病打下堅實的基礎。

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