華北大黑鰓金龜幼蟲腸道菌的分離及對農藥的降解

孫勇++曹小迎+++蔣繼宏++張先道

摘要：采用4種培養基對金龜幼蟲腸道內微生物進行分離培養，并通過16S rRNA測序進行初步鑒定，將分離獲得的菌株接種于含辛硫磷和毒死蜱的基礎鹽培養基上，初步測定對腸道內微生物降解農藥的能力。結果表明，選用的4種培養基中，淀粉-酪素培養基獲得的微生物數量最多，羧甲基纖維素鈉培養基次之，甘油天門冬氨酸培養基最差。對13株有代表性的菌株進行測序分析，初步鑒定這些微生物分屬9個屬，在分離篩選的菌株中隨機挑選供試的28株菌株中，在以毒死蜱（濃度100 mg/L）為唯一碳源的基礎鹽培養基中，能形成菌落的菌株為8株，在以辛硫磷為唯一碳源的基礎鹽培養基中，能形成菌落的菌株為19株，表明腸道中有一些微生物對農藥有降解作用，其中對辛硫磷降解作用優于毒死蜱，說明在防治華北大黑鰓金龜時，毒死蜱防治效果可能優于辛硫磷。

關鍵詞：華北大黑鰓金龜；腸道微生物；分離；農藥降解

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0151-03

收稿日期：2015-03-26

基金項目：江蘇師范大學省藥用植物生物技術實驗室開放課題（編號：KLBMP1305）。

作者簡介：孫勇（1977—），男，江西高安人，碩士，講師，從事應用微生物學研究。E-mail：sunyong23@jsnu.edu.cn。

通信作者：蔣繼宏，教授。Tel：（0516）83403515；E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn。我國農藥使用技術水平和農藥的利用率都比較低，而更多的農藥在施用后則進入了土壤、水體和空氣中，對非靶標生物和各個生態因子產生了嚴重影響，最終導致了農產品品質低劣和農藥殘留超標[1-2]。長期大量使用農藥使害蟲產生一定的抗藥性，因此要想殺死害蟲就得加大藥量，害蟲的抗藥性不斷增強，農藥使用量不斷加大，就會形成惡性循環，環境污染問題日益嚴重，國家環保局也發布：農藥殘留污染已被列為環境污染重點治理的工程之一，因此解決農藥污染問題勢在必行。生活在這些農藥環境中的微生物，為了自身生存，與這些污染源一直在進行著斗爭，隨著時間的推移，它們之間形成了一種協同進化關系，這些微生物具備了降解和利用這些污染源的機制。農藥生物修復是利用特定的生物吸收、轉化、清除或降解農業生態環境中農藥污染，實現農業生態環境凈化、生態功能恢復的生物措施。而且已有大量研究表明細菌、真菌、放線菌、藻類等微生物對農藥有很好的降解作用[3-10]，它們大多數來自土壤微生物類群。華北大黑鰓金龜為鞘翅目鰓金龜科昆蟲，分布在我國東北、華北、西北等地區，主要危害楊、柳、榆、桑、核桃、蘋果、刺槐、櫟等林木葉片，幼蟲危害闊、針葉樹根部及幼苗；幼蟲棲息在土壤中，取食萌發的種子，造成缺苗斷壟；將根莖、根系咬斷，使植株枯死，且傷口易被病菌侵入，引起其他病害發生。華北大黑鰓金龜幼蟲生活在土壤中，且長期接觸化學農藥（辛硫磷和毒死蜱是常見的用來殺滅大黑鰓金龜的化學農藥），腸道內可能含有一些能降解農藥的微生物，因此我們分離了華北鰓金龜幼蟲腸道中微生物，采用16S rRNA序列分析進行了初步鑒定，并就農藥降解能力進行了初步篩選。

1材料與方法

1.1供試材料

華北大黑金龜鰓幼蟲：取冬眠期幼蟲。

1.2培養基

TNYE培養基：酵母膏 0.25 g，K2HPO4 0.5 g，瓊脂 15.0 g，pH值為7.2，NaCl 10%，水1 L，pH值7.2。

淀粉-酪素培養基：葡萄糖5 g，可溶性淀粉5 g，蛋白胨2 g，酵母膏1 g，CaCO3 2 g，瓊脂15 g，pH 值 7.2，NaCl 10%，水1 L，pH值7.2。

甘油天門冬氨酸培養基：甘油10 g，L-天冬氨酸1 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 0.1 g，瓊脂15 g，pH值 7.2，NaCl 10%，水1 L，pH值 7.2。

羧甲基纖維素鈉培養基：羧甲基纖維素鈉20.0 g，磷酸氫二鈉2.5 g，磷酸二氫鉀1.5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，瓊脂15.0 g，水1 L，pH值7.2。

ISP2培養基：酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，葡萄糖 4 g，水1 L，瓊脂15 g，pH值7.2。

LB培養基：胰化蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，pH值7.0。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，20 g瓊脂，1 L水。

基礎鹽培養基：

NaCl 1.00 g，NH4NO3 1.00 g，K2HPO4 1.50 g，KH2PO4 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.10 g，水1 L，pH值7.0。

1.3金龜幼蟲腸道微生物的分離

清洗5支試管，每支試管注入10 mL蒸餾水，加上試管塞，用高溫滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，取出后使其冷卻至室溫，并標上編號為1、2、3、4、5。打開無菌操作臺進行紫外滅菌。選取冬眠的金龜幼蟲放入75%的乙醇中浸泡2 min，在無菌操作臺上取出蟲體放在培養皿中無菌解剖。取少量腸道里白色物質，放入標號為1的試管，然后蓋上試管塞搖晃使微生物分布均勻，取出后在無菌操作臺上進行梯度稀釋。從稀釋103倍和104倍的菌液中取50 μL，分別滴入供分離用的培養基中（分離培養基：TNYE培養基，淀粉-酪素培養基，甘油天門冬氨酸培養基，羧甲基纖維素鈉培養基），涂布均勻，把培養皿倒置放入恒溫保溫箱內30 ℃培養8 d。觀察菌落生長情況，統計菌落數，并挑取部分菌株轉接于試管中保存。

1.4部分分離菌株的初步鑒定

通過測定16S rRNA 基因序列進行初步鑒定，分離菌株總DNA 的提取參照文獻[11]的方法進行，PCR 擴增采用細菌16S rRNA 通用引物（27F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；1492R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）。PCR 反應條件為：94 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，共35 個循環，72 ℃ 10 min。PCR 產物用經EB 染色的0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序。依照測序結果，從NCBI （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數據庫中調出相似性較高相關菌株的16S rRNA基因序列，進行序列比對分析。

1.5降解辛硫磷和毒死蜱菌株的篩選

配制含辛硫磷和毒死蜱有效成分100 mg/L基礎鹽培養基，將分離獲得的菌株接種于培養基上，置于28 ℃ 恒溫培養箱中培養，生長狀況良好（能形成菌落）的即定為可降解菌。

2結果與分析

2.1各培養基菌株分離情況

由表1可知，選用的4種培養基培養微生物，淀粉-酪素培養基獲得的微生物數量最多，0.5 g濕樣/mL在稀釋103倍下平板菌落數162個，稀釋104倍下獲得菌落數36個，羧甲基纖維素鈉培養基次之，甘油天門冬氨酸培養基最差，在稀釋103倍下平板菌落數為30個。

2.2分離獲得的菌株種類情況

從各種培養基中共挑取菌株65株，細菌保存于含LB培養基斜面試管中，放線菌保存于含ISP2培養基斜面試管中，從65株菌株挑取了13株有代表性的菌株進行測序分析，由比對結果（表2）可知，幼蟲腸道微生物至少包括原小單孢菌屬（Promicromonospora）、纖維微菌屬（Cellulosimicrobium）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、冢村氏菌屬（Tsukamurella）、壤霉菌屬（Agromyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、詹森菌屬（Janthinobacterium）、小單孢菌屬（Micromonospora）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等9個屬。

2.3腸道微生物對2種農藥的降解情況

挑選部分獲得的菌株，進行降解毒死蜱和辛硫磷的試驗，結果見表3。

供試的28株菌株中，在以毒死蜱（濃度100 mg/L）為唯一碳源的基礎鹽培養基中，能形成菌落的菌株為8株，占供試菌株28%，在以辛硫磷為唯一碳源的基礎鹽培養基中，能形成菌落的菌株為19株，占供試菌株67.8%，對毒死蜱和辛硫磷都能降解的有CH1、CH19、CH32、CH33、CH44、CH47（Sac

3討論

華北大黑鰓金龜幼蟲腸道微生物的分離試驗選用的4種培養基中，淀粉-酪素培養基分離效果最好，甘油天門冬氨酸培養基分離效果最差。因此，在做腸道微生物分離試驗時建議使用淀粉-酪素培養基。

通過研究表明，一些腸道微生物對農藥有降解作用，本試驗中，華北大黑鰓金龜幼蟲腸道微生物對辛硫磷降解作用優于毒死蜱，說明在防治華北大黑鰓金龜時，毒死蜱防治效果可能優于辛硫磷，腸道微生物的降解作用可能是昆蟲產生抗藥性的原因之一。在農藥降解上，微生物菌劑的使用也可能導致害蟲獲得有分解農藥的菌株，為防止用藥量上的惡性循環，建議使用具有降解農藥菌株的代謝產物進行農藥降解，而不應直接使用微生物菌體。

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