病毒樣顆粒及其原核表達制備的研究進展

于天飛 張喜文 謝鵬宇 黎 明 樊興冬 閆 冰

(1齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院 161006； 2齊齊哈爾大學計算機與控制工程學院 161006；3黑龍江省獸醫(yī)科學研究所 齊齊哈爾 161006)

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是由病毒的結構蛋白在體外或體內(nèi)自組裝而形成的空心顆粒，不含有病毒的遺傳物質[1]。VLPs被認為是非常有效的疫苗載體，很多抗原可以通過基因工程或化學耦連的方法在VLPs表面展示[2]。與傳統(tǒng)疫苗相比，VLPs具有良好的免疫原性和極高的安全性，是一種理想的疫苗形式[3]。此外，VLPs還可作為載體蛋白攜帶外源抗原，是疫苗設計的重要平臺[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)近40種病毒的蛋白能形成VLPs。其中，已上市的3種乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、2種人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)和1種戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)等人類病毒基因工程疫苗均采用VLPs疫苗形式[5]。其他一些針對人或動物疾病的VLPs疫苗也已經(jīng)處于臨床實驗階段[6]。VLPs在科學研究以及商業(yè)開發(fā)，特別是基因治療等方面具有極大的應用優(yōu)勢。

1 VLPs的結構

VLPs由1種或幾種結構(衣殼)蛋白構成，通過自我組裝形成。不同病毒的VLPs的結構不盡相同：有的由1種或2種結構蛋白組成，稱為簡單VLPs(如細小病毒、乳頭瘤病毒、圓環(huán)病毒、戊型肝炎病毒和多瘤病毒等)；有的是由數(shù)個獨立mRNAs編碼的結構單位構成的復雜結構(如微小RNA病毒等)；還有的具有來自宿主細胞的磷脂雙分子層的脂質囊膜，其上還可能鑲嵌有糖蛋白形成的纖突蛋白(如流感病毒、艾滋病病毒和丙型肝炎病毒等)[7～9]。

2 VLPs誘導免疫應答

VLPs易于被免疫系統(tǒng)識別，能激發(fā)機體產(chǎn)生保護性免疫應答，其誘導機體產(chǎn)生免疫應答的方式包括：通過表達在其表面的多價結構結合Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)和模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)激發(fā)固有免疫應答反應；誘導強烈的體液免疫應答并產(chǎn)生高水平的IgM；通過主要組織相容性復合體I(MHC I)和主要組織相容性復合體II(MHC II)的交叉呈遞途徑增強抗原呈遞細胞的攝取、加工和呈遞抗原的能力。同時，VLPs的體積較小(平均直徑約40 nm)，使其容易通過淋巴管進入淋巴結中。在淋巴結，VLPs可以被定居于淋巴結中的樹突狀細胞攝取，而VLPs本身較小的尺度和高度有序的表位結構易于樹突狀細胞的吞噬和抗原加工處理，從而有效地誘導機體產(chǎn)生對病毒的免疫保護反應[10～12]。

3 VLPs的制備方法

通常利用重組蛋白表達系統(tǒng)表達結構蛋白后進行體外或體內(nèi)組裝的方法來制備VLPs。制備VLPs的蛋白表達系統(tǒng)可分為真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)。據(jù)統(tǒng)計，在已報道的VLPs中，利用真核表達系統(tǒng)制備的為72%(桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)28%，酵母表達系統(tǒng)20%，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)15%，植物表達系統(tǒng)9%)，利用原核表達系統(tǒng)制備的為28%[13]。

真核表達系統(tǒng)具有蛋白輔助折疊與后期修飾等功能，大部分病毒的衣殼蛋白在真核系統(tǒng)都能自組裝形成VLPs。但是由于真核表達系統(tǒng)常面臨培養(yǎng)周期長、成本高、表達量低和難純化等難題，制約了VLPs疫苗的研發(fā)和應用。制備VLPs的原核表達系統(tǒng)主要為大腸桿菌表達系統(tǒng)。與真核表達系統(tǒng)相比，原核表達系統(tǒng)更早、更廣泛地被應用于生物醫(yī)藥領域，并且是公認的高效、低成本、安全性良好的蛋白表達系統(tǒng)。原核表達系統(tǒng)一般用來制備無囊膜的VLPs[14]。

4 VLPs的原核表達制備

大腸桿菌來源的VLPs產(chǎn)量高、成本低，尤其適合開發(fā)面向全世界，特別是面向大多數(shù)發(fā)展中國家的新型疫苗。但是由于顆粒性抗原結構和組裝都較為復雜，因此在大腸桿菌中的VLPs組裝效率較低。同時，原核表達系統(tǒng)缺少像真核表達系統(tǒng)那樣的重組蛋白表達后的修飾能力，不能產(chǎn)生正確的二硫鍵，表達的重組蛋白的可溶性較差，在表達重組蛋白的過程中會產(chǎn)生脂多糖或內(nèi)毒素成分。因此，如何利用大腸桿菌進行顆粒性抗原的表達和組裝是當今疫苗界的難題之一[14]。近幾年來，在利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備VLPs的技術取得了一系列突破。

病毒衣殼蛋白可以通過原核表達系統(tǒng)表達成包涵體，包涵體在變性條件下純化，然后復性再折疊，再進過自我組裝等過程而有效制備，例如人細小病毒(human parvovirus)B19和植物病毒豇豆褪綠斑點病(CCMV)及黃瓜花葉病毒(CMV)的VLPs的制備。另外，也可以同時表達多個結構蛋白，進行多層顆粒共組裝，例如傳染性法氏囊病毒的VLPs的制備，該病毒的VLPs由VP2、VP3和VP4三種多聚蛋白構成，可以加以表達和組裝[15]。

簡單的培養(yǎng)條件的改變，如通過低溫培養(yǎng)增強重組蛋白可溶性，即可解決正確構象VLPs的自組裝等難題，如濃核病毒IHHNV和馬鈴薯Y病毒(PVY)的制備[16]。另有一些因素，包括表達質粒上的標簽蛋白和培養(yǎng)基中的一些成分，也可以影響VLPs的組裝。可通過應用不同的融合蛋白表達系統(tǒng)來增加重組蛋白的表達水平和可溶性，如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合蛋白[17]。

也有其他的原核表達宿主被用來制備VLPs，如lactobacillus乳酸菌。有報道稱在在干酪乳桿菌(乳糖誘導表達菌株)體內(nèi)可通過自我折疊形成人乳頭狀瘤病毒L1株的VLPs。此外，由干酪乳桿菌制備的L1 VLPs 可以用來作為新型的黏膜免疫活疫苗[18]。熒光假單胞桿菌表達系統(tǒng)具有操作簡單、可高效表達可溶性蛋白及培養(yǎng)基譜廣泛等優(yōu)點，可以作為大腸桿菌的替代表達系統(tǒng)來制備VLPs。植物病毒雀麥花葉病毒(BMV)和CCMV的衣殼蛋白已經(jīng)通過熒光假單胞桿菌表達系統(tǒng)在菌體內(nèi)可溶性表達，所獲VLPs與天然病毒顆粒相似[19]。

5 展望

VLPs作為傳染病和非傳染病疫苗的候選具有極大的優(yōu)勢。VLPs在沒有傳統(tǒng)免疫佐劑的存在下自身即可激發(fā)有效的免疫應答。VLPs具有和宿主細胞天然的親和能力，具有細胞靶向作用的潛能。基于VLPs的這些優(yōu)勢，有必要對VLPs進行深入的研究。迄今，雖然已經(jīng)有數(shù)十種的VLPs在實驗室中成功制備，但只有極少數(shù)能夠在疫苗應用中取得突破，獲得合適的放大制備工藝、組裝工藝和制劑工藝組合是阻礙其發(fā)展的重要原因。大腸桿菌表達系統(tǒng)在基因工程藥物中已經(jīng)得到了廣泛的應用，但在利用其制備和組裝大尺度的、結構復雜的VLPs方面仍然存在諸多問題。從蛋白質結構優(yōu)化和分子設計入手，同時進行與大腸桿菌的外源表達調控機制相關的功能基因改造，使其更適合VLPs的表達和組裝，可能是解決問題的途徑。