CRISPR/Cas系統
——基因組定向編輯新技術

曹 博 趙怡霞 江 嫚

(北京市第四中學順義分校 101318)

朱 琳

(陜西省勉縣第二中學 724200)

基因組編輯技術是利用核酸酶對基因組進行定向編輯的技術，主要用于研究特定基因的功能[1]。目前用于基因組編輯的核酸酶主要分為三類：鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)和歸巢核酸內切酶(engineered meganucleases)。近年來，在分子生物學領域出現了一種新興的RNA導向的基因組定點編輯技術—— CRISPR/Cas[2]，該系統因為操作簡單、成本低等特點，迅速得到認可，并在不同研究領域得到廣泛應用。

1 CRISPR/Cas系統結構

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是指最初來自于E.coliK12 堿性磷酸酶基因附近區域的成簇的規律間隔的短回文重復序列[3]，隨后發現約40%左右的已測序細菌基因組都存在CRISPR位點。Cas(CRISPR-associated nuclease)是存在于CRISPR位點附近的一系列保守基因，往往與重復序列相連，在 CRISPR 的防御體系中起關鍵作用。在Cas基因附近有一段幫助CRISPR RNA (crRNAs)成熟的轉錄活化RNA(tracrRNA)。通過CRISPR /Cas系統，細菌構建了一種特殊的防御系統，進而可以有效抵抗外源基因侵擾。根據Cas基因核心元件的不同，CRISPR /Cas系統可以分為三種類型：I型、II型和III型。其中I型和III型需要多個Cas蛋白形成復合體切割DNA雙鏈，而II型只需要一個Cas9蛋白核酸酶進行切割，因此成為目前應用最為廣泛的CRISPR/Cas9系統[4]。

2 CRISPR/Cas系統原理

II型CRISPR/Cas系統由三部分組成：tracrRNA、Cas9 核酸酶和pre-crRNA[5]，其具體作用機制可分為三個步驟：①適應階段：Cas蛋白復合物靶向尋找并裂解外源基因中的原型間隔序列(protospacer)，隨后protospacer整合到CRISPR位點5′端，并被轉錄成crRNA。外源基因再次進入時，CRISPR的重復序列會截取其中的一些片段，并將其轉錄形成pre-crRNA，之后與tracrRNA的重復序列結合。②成熟階段：pre-crRNA/tracrRNAs復合體在內源 RNase III的作用下，位于5′末端的間隔序列被切除，形成成熟的 crRNA，并與 tracrRNA 形成向導 RNA (sgRNA)。③干擾階段：成熟的sgRNA能夠招募 Cas9蛋白，形成crRNA-tracrRNA-Cas蛋白復合體，引導Cas蛋白識別并結合雙鏈DNA靶位點，接下來在原型間隔毗鄰序列(PAM)的上游 3～8 bp 位置對結合序列進行切割。

crRNA-tracrRNA-Cas蛋白復合體對DNA序列進行切割以后，會在特定的基因組位置造成DNA 雙鏈斷裂，進一步激活細胞內的兩種DNA修復機制：同源重組或非同源末端連接，從而實現對基因組的定點修飾[5]。

3 CRISPR/Cas系統應用

3.1 在生物學研究中的應用 目前，使用CRISPR/Cas技術進行的基因定點編輯已在包括動物、植物、微生物等在內的多個物種中廣泛應用。在常見的細胞系如HEK293、U2OS、K562，以及經典模式生物如小鼠、果蠅、線蟲、水稻、擬南芥、釀酒酵母、大腸桿菌等多種生物中進行的基因編輯均獲得成功(表1)[5]。同時，我國科學家黃行許等在靈長類動物體內進行的多位點基因編輯也獲得理想效果[6]，表明CRISPR/Cas系統及其作用機制在整個生物界具有普遍性。在CRISPR/Cas系統的基礎上，研究者對其功能進一步完善和開發[7]，例如，利用缺失核酸酶活性的Cas9(dCas9)與功能蛋白或RNA結合，可以調控基因的表達和染色體結構；利用dCas9和向導sgRNA，可以將單個因子結合到特定位點，精確研究基因功能和調控機制。

3.2 在生物技術中的應用 在生物技術研究方面，特別在疾病相關模型的構建方面，CRISPR/Cas具有非常廣闊的應用前景。例如，染色體易位常常與腫瘤的發生密不可分，利用CRISPR/Cas可以對腫瘤相關的染色體易位進行精確研究。Choi等利用 CRISPR/Cas9將DSBs準確引入人胚腎HEK293T細胞和肺上皮細胞AALE中，模擬肺癌中ROS1基因和CD74基因的染色體易位，說明Cas9所誘導的雙鏈斷裂能夠實現染色體靶向易位。隨后，Chen等和Torres等分別在白血病和尤文氏肉瘤的染色體易位中得到證實[1]。利用CRISPR/Cas9技術，Xue等和Heckl等在小鼠中分別建立了肝癌和髓系惡性腫瘤的致癌模型，顯示 CRISPR/Cas9可用于研究腫瘤發生過程中的基因重組機制[1]。

CRISPR/Cas9也是系統研究哺乳動物基因功能的有力工具。Wang等和Zhou等創建了慢病毒聚焦型人源細胞sgRNA文庫，可以對功能基因進行篩選，也可用于篩選與腫瘤細胞和多能干細胞細胞活性相關的基因[1]。利用這一工具，可以有效降低CRISPR/Cas9的脫靶效應，進行大規模篩選藥物靶點以及非模式生物中的基因功能定位等研究。

CRISPR/Cas9系統還可以用于真核生物基因表達的精確調控研究。Qi等人發現，缺失核酸內切酶活性的dCas9可以形成復合體，與RNA聚合酶結合，從而特異性抑制轉錄延伸，表現為CRISPR干擾(CRISPRi)現象[8]。借助這一手段，Gilbert 等和Konermann等對KRAB和SID轉錄抑制因子進行修飾，從而加強了表觀遺傳沉默程度[7]。同時，Cas9也可作為合成的轉錄激活因子，單一sgRNA導向的Cas9激活因子會引起特定內源基因啟動子的適度轉錄上調，若使用多個sgRNA聯合導向，則可呈現出協同效應，從而大大增強激活程度。

此外，CRISPR/Cas9在表觀遺傳調控方面的研究也取得了重要進展。Cas9表觀遺傳因子(epiCas9s)可以在特定位點插入或去除特定的表觀遺傳標記(甲基化、乙酰化等)，進一步確定特定表觀遺傳標記在整個基因組調控網絡中的作用。Kearns等通過將缺失核酸內切酶活性的dCas9和組蛋白去甲基化酶結合，靶向多個基因啟動子和增強子，并闡明其作用機制，表明CRISPR/Cas9可作為研究表觀遺傳調控中單個標記的重要工具[9]。

3.3 在疾病診療中的應用 利用CRISPR-Cas9技術，可以對遺傳性疾病相關的基因突變進行定點修復，并可破壞侵入的病毒基因組。例如，Wu等在小鼠中成功修復了與白內障發生相關的Crygc基因。Schwank等通過同源重組的方法，在囊腫性纖維化病人的小腸干細胞中對相關的CFTR位點進行修復，這一研究不僅為體內或體外干細胞中定向引入、修飾特定基因提供思路，也為獲得特定遺傳修飾的“類器官”(迷你器官)奠定基礎[1]。

利用CRISPR-Cas9技術在高等動物體內進行的多基因編輯也取得了突破性進展。我國學者黃行許等成功利用 CRISPR/Cas9 系統對孿生的食蟹猴進行基因修飾[6]，為世界上首次在靈長類動物中進行基因編輯，且同時進行了三個基因的精確定向修飾，表明該技術在研究多基因引起的復雜的神經疾病方面具有巨大潛力。

3.4 在農業生產中的應用 在農業生產中，CRISPR-Cas9的研究主要集中在植物和真菌。例如，國內高彩霞實驗室利用CRISPR-Cas 系統首次在植物中進行定點突變。其中，在水稻和小麥中定點突變了OsPDS和TaMLO等5個基因，在水稻原生質體和轉基因植株中均得到了較高的突變率[10]。同時，通過同源重組 DNA 修復途徑，利用單鏈寡核苷酸 DNA (ssDNA )作為模板，在基因特定位點精確插入 12bp限制性內切酶識別序列，在世界上首次證實CRISPR/Cas系統能夠用于作物基因組定點編輯，該技術的突破有望加速重要農作物水稻、小麥性狀改良與分子定向育種。

利用CRISPR-Cas9技術在植物中進行的基因定向編輯具有穩定、持久等特點。Li等利用同源重組的方法，在擬南芥和本氏煙中成功進行基因編輯，隨后在小麥、水稻、高粱、甜橙等不同的作物中均有報道[11]。Zhang等在水稻中利用guide RNA進行編輯，發現約50%的胚細胞中靶基因被編輯，并且編輯發生在第一次細胞分裂之前[12]。進一步研究表明，這些遺傳改變可以傳遞給下一代，不會出現變異或恢復，全基因組測序結果也顯示未出現大量脫靶現象。結果表明，植物本身進化出來的防御病蟲害或極端環境的修飾機制，可能比其他技術性的修飾更容易。

4 CRISPR/Cas研究展望

作為一種新型的基因定向編輯技術，CRISPR/Cas已經在動物、植物、微生物等不同物種中獲得了巨大成功。隨著該技術的不斷普及，在動植物基因功能領域即將迎來一次新的革命，從而為生物學研究帶來新的機遇和挑戰。與此同時，CRISPR/Cas也引發一些新的問題，例如，其本身存在的“脫靶效應”、與胚胎細胞基因編輯相關的倫理學問題[5]等。但隨著研究的不斷深入，CRISPR/Cas技術將會逐步成熟和完善，更加有效地應用于生物學研究的各個領域。