先兆子癇動物模型的制備

李冬冬, 朱 敏, 龐琴霞, 丁佩芳

(同濟大學附屬楊浦醫院婦產科, 上海 200090)

·綜 述·

先兆子癇動物模型的制備

李冬冬, 朱 敏, 龐琴霞, 丁佩芳

(同濟大學附屬楊浦醫院婦產科, 上海 200090)

先兆子癇(PE)是以高血壓、蛋白尿、水腫為主要臨床特征的婦產科疾病，并常伴有全身多個臟器損害， 是嚴重威脅母嬰安全、導致孕、產婦及圍生兒發病及死亡的重要原因，其病因及發病機制至今尚未完全明確。借助PE動物模型開展相關研究，是闡明該疾病的發病機制或藥物療效的重要手段。目前，該疾病的造模方法主要分為環境刺激法、化學藥物干擾法、手術干預法、基因干預法四類。所選擇的動物主要有大鼠、小鼠。此外，家兔、犬、獼猴、狒狒、羊等在手術干預法中也有應用。在PE發病機制的研究中，動物模型起著重要作用，本文對PE動物模型制備方法進行綜述，并進一步介紹了各種方法制備的動物模型的評價標準及其特點。

先兆子癇(PE); 動物模型; 制備; 綜述

先兆子癇(pre-eclampsia, PE)是婦產科中常見的以妊娠婦女在妊娠20周以后出現高血壓、蛋白尿等臨床特征的一種綜合征[1]。據統計, PE發病率約占所有妊娠婦女的3%～5%, 該病除引發患者血壓升高、蛋白尿和水腫外, 還可能會導致胎盤早剝、彌漫性血管內凝血、子癇, 出現以溶血(hemolysis)、肝酶升高(elevated liver enzyme)和血小板減少(low platelets)為特點的HELLP 綜合征，并且可能出現腎功能衰竭、腦血管意外等嚴重并發癥，重者可發展為子癇及多個臟器功能衰竭，該病是導致孕、產婦及圍生兒死亡的重要原因[1,2]。

關于PE發生機制目前尚不十分清楚，其主要發病機制觀點包括: 氧化應激學說、遺傳學說和血管內皮損傷學說、胎盤或滋養細胞缺血缺氧學說、免疫調節異常學說等[3]，這些學說能夠從某個角度解釋該病的發病過程[4]，但是很難全面的揭示PE疾病的本質。為進一步揭示或驗證人類PE發生發展的詳細機制，早日解釋該病本質，需要進行更加深入全面的研究。其中借助人類疾病動物模型開展相關研究是重要手段。目前，尚沒有動物發生與人類相似的自發性子癇及PE的報道[5,6]，因此深入研究PE動物模型制備方法，制備理想的PE模型具有非常重要意義。本文對目前研究中常用的動物模型制備綜述如下。

1 環境刺激法

目前主要采用寒冷刺激法。

1.1 模型復制方法

Kanayama等[7]研究表明，連續2周對妊娠大鼠進行足底局部寒冷刺激，可誘發妊娠高血壓綜合征樣改變。隨后諸多學者[8,9]對該方法進行了改進，將成年 Wistar 大鼠，自妊娠 1 d至妊娠14～19 d每日定時置于4 ℃寒冷環境中(4 h/次)，其余時間飼養在室溫 25 ℃環境中，約14 d即可成模。

1.2 成模標準及其特點

連續2周寒冷刺激后，如檢測到妊娠鼠收縮壓及尿蛋白濃度均顯著低于正常值，即可證明模型制備成功。該模型制備不經歷任何藥物干預及手術損傷過程，對動物損傷較小，比較接近人類妊娠高血壓的發病過程及病理狀態，其出現紅細胞壓積升高、胎鼠宮內發育遲緩等癥狀，與人類妊娠高血壓的表現較為相似。模型動物腎小球基底膜增厚，同時系膜細胞出現增生，可以觀察到腎小管上皮廣泛的濁腫或者空泡樣變病變，胎盤蛻膜帶與基帶均呈現增厚，迷路帶血間膜增厚常伴隨出現纖維蛋白沉積等病變[8,9]，這與人類妊娠高血壓綜合征的腎臟、胎盤的病理改變相一致。同時寒冷刺激方式也符合人類在寒冷環境中的生活習慣。因此該方法制備的動物模型是比較理想的研究人類PE等妊娠期高血壓的材料。

2 化學藥物干擾法

2.1 內毒素(LPS)誘導

2.1.1 模型復制方法 Fass 等[10]早在1994年就已經嘗試采用內毒素(LPS)構建大鼠的PE動物模型，方法是選用雌性Wistar大鼠，在妊娠14 d沿鼠尾靜脈緩慢注入LPS(1.0 μg/kg體質量)，可成功制備該模型[11]。選用SD大鼠按照此方法亦可成功制備該模型[12,13]。

2.1.2 成模標準及其特點 妊娠14 d起每日測量1次大鼠尾動脈收縮壓。如果妊娠鼠動脈壓升高超過16 kPa(正常血壓值為14.5±0.5 kPa)，同時尿蛋白水平顯著升高，出現胎盤炎性改變，則認為妊娠鼠處于PE期，模型制備成功[10-14]。此外，內毒素處理大鼠的腎小球出現血小板凝血及纖維蛋白原沉積。本方法制備的大鼠PE模型成功率較高，可產生持續的高血壓、尿蛋白升高。此外，該疾病模型胎盤所表現的慢性炎癥反應，如：蛻膜帶腫脹增厚，迷路帶可見組織核碎裂、纖維蛋白沉積，基帶呈現出炎性細胞浸潤等癥狀與人PE表現非常相似[15,16]。因此，該模型是研究人類PE的常用動物模型。

2.2 血管內皮生長因子誘導

2.2.1 模型復制方法 亞硝基左旋精氨酸甲酯(LNAME)是NO合成酶抑制劑，可以競爭性抑制體內NO的合成，具有抑制血管內皮生長因子(VEGF)的作用。1997年，Shi等[7]首次報道給妊娠大鼠靜脈注射L-NAME可以產生典型的PE癥狀，并且不會影響妊娠期，隨后該模型得到大量應用[17,18]。目前，用L-NAME制備該模型的方法較多，如給成年雌性Wistar大鼠在妊娠15 d起，連續5 d每日腹腔注射L-NAME 300 mg/kg，即可制備大鼠PE模型[19]。Shi等[20]選擇妊娠9～19 d大鼠連續腹腔注射L-NAME(250 mg·kg-1·d-1)的方式制備該模型。給妊娠12 d(或14 d) Wistar大鼠皮下連續注射7 d L-NAME (125 mg·kg-1·d-1), 或者妊娠14～21 d靜脈注射L-NAME(50 mg·kg-1·d-1)亦可制備該模型[21,22]。Liu等[23]選用SD大鼠, 妊娠13 d 起, 連續4 d皮下注射L-NAME (200 mg·kg-1·d-1)也得到了癥狀典型的PE模型。此外, 研究證實[24,25]可溶性血管內皮生長因子受體-1(sFlt-1)在人類PE發生中起重要作用，如給妊娠9～16 d ICR小鼠連續腹腔注射重組小鼠sflt-1-fc，或者用微型滲透泵給向妊娠13 d SD大鼠注射sFlt-1，均可得到癥狀典型的PE模型。

2.2.2 成模標準及其特點 血壓和24 h尿蛋白是評價該動物模型成功的關鍵指標。注射L-NAME 或者sFlt-1后24 h，妊娠鼠尾動脈收縮壓及尿蛋白如果顯著升高，提示模型制備成功。該方法誘導的動物模型可以導致腎臟功能損傷，產生尿蛋白增多, 腎小球結構性病變、腎小管出現蛋白管型[21]，這些病變與人類該疾病的腎臟病變特別相似[26]。此外，該方法造模可以導致妊娠鼠胎盤血液注入量減少，使妊娠鼠胎盤面積減少，出現炎性細胞浸潤、組織壞死增生、出血性梗死等胎盤病理性變化[27]。因此，該方法具有操作簡單、成模率高、癥狀更加準確可靠等特點。需要注意的是該方法有可能導致子代發育畸形。

2.3 阿霉素誘導

2.3.1 模型復制方法 以5 mg/kg體質量的阿霉素，對成年雌性Wistar大鼠進行腹腔注射，4周后與雄性大鼠交配，使其妊娠，即可制備該模型[28]。

2.3.2 成模標準及其特點 阿霉素注射后可引起大鼠蛋白尿和高血壓，妊娠后，其尿蛋白、高血壓進一步升高[28-31]，說明模型制備成功。由于阿霉素模型在妊娠前有腎臟基礎疾病,而且腎臟疾病是PE發病的危險因素之一, 因此，阿霉素模型在研究PE與腎臟損害方面有其特有作用。同時，該模型造成大鼠腎臟長期損傷，大鼠妊娠后腎臟繼續遭受持續性損害, 因此, 該模型應用有較大局限性。

2.4 磷脂酰絲氨酸(PS)/磷脂酰膽堿(PC)誘導

2.4.1 模型復制方法 給妊娠5.5～16.5 d ICR小鼠，每日尾靜脈注射1 mg含20%磷脂酰絲氨酸(PS)和80%磷脂酰膽堿(PC)混合液，即可誘導小鼠PE樣癥狀[32,33]。

2.4.2 成模標準及其特點 該模型主要評價指標為血壓、尿蛋白。此外，腎組織和胎盤病理學變化也可用于該模型的評價。注射數日后便可導致妊娠鼠血壓顯著升高，尿蛋白水平上升，腎小球毛細血管處膠原纖維增生，胎盤出現廣泛纖維蛋白沉積和微血栓形成，引起一系列人類PE樣改變[32,34,35]。該模型適用于PE發生中胎盤病理和抗凝治療PE疾病的研究。

2.5 Toll樣受體9激動劑誘導

2.5.1 模型復制方法 目前研究[36,37]顯示, PE母體循環過程中增加的線粒體DNA與胎兒DNA是Toll樣受體9(toll-like receptor 9, TLR9)內源性配體, 它能夠刺激TLR9引起免疫反應, 進而導致系統性炎癥以及引發血管功能性障礙。針對該機制, 徐鑫等[38]在C57BL/6J小鼠妊娠7.5 d, 腹腔注射TLR9激動劑ODN1826(5 mg/kg)，成功構建了PE小鼠模型。

2.5.2 成模標準及其特點 注射后3 d可檢測到模型小鼠血壓與尿蛋白均顯著升高，證明模型制備成功。與對照組相比, 模型小鼠除了高血壓、蛋白尿等PE樣癥狀外, 還伴有胎鼠子宮內發育遲緩，并可誘發人類患者相似的胎盤病變, 例如: 胎盤迷走帶滋養細胞增生, 形成微血栓, 絨毛間質水腫纖維素樣壞死以及梗死鈣化灶增多[38]。該方法主要是干預免疫系統, 誘發小鼠產生人類PE樣癥狀, 造模簡單, 是研究炎癥反應在PE發病中作用的良好方法。

2.6 白細胞介素、TNF-α等細胞因子誘導

2.6.1 模型復制方法 研究證實[39,40]給妊娠14～19 d SD大鼠, 用微滲透泵恒量灌注重組大鼠白細胞介素-6(IL-6, 5 ng/d), 能夠引發妊娠大鼠妊娠高血壓癥狀。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是胎盤缺血和人類PE血壓升高的重要關聯因素[41,42]，采用上述同樣方法給妊娠大鼠注射TNF-α(50 ng/d)也可引起妊娠鼠血壓升高[43,44]。

2.6.2 成模標準及其特點 IL-6灌注大鼠妊娠19 d能夠檢測到血壓較正常對照組升高3倍以上，血管緊張素II型受體(AT1-AA)、IL-6水平亦顯著上升，證明模型制備成功[39,40]，可用于相關實驗研究。TNF-α灌注也能夠產生顯著的血壓升高和AT1-AA水平上升。此外，研究[45-48]顯示人類妊娠期血漿中也會出現IL-6、TNF-α水平的顯著上升，因此，

該方法較好驗證了單一因素對PE發生的影響，是研究IL-6、TNF-α在PE發生中作用的良好材料。但是單一的細胞因子并不是影響孕婦血壓及參與胎盤缺血損傷胎兒灌注和增長的唯一因素，這種模型的應用有很大的局限性。另有研究[49]證實, 給予妊娠14～19 d SD大鼠IL-17(150 ng/d)，可引起大鼠血壓明顯升高，胎盤氧化應激反應升高，AT1-AA水平上升。 妊娠10～17 d給C57BL/6J小鼠連續腹腔注射IL-11(500 μg·kg·d-1)或者激活素A，妊娠鼠可產生血壓升高、尿蛋白升高等PE癥狀[50,51]。

2.7 糖皮質激素誘導

2.7.1 模型復制方法 地塞米松是一種長效糖皮質激素，給妊娠7～13 d SD大鼠每日皮下注射地塞米松磷酸鈉(2.5 mg/kg)，可成功誘發大鼠產生PE樣疾病癥狀[52]。

2.7.2 成模標準及其特點 地塞米松處理后，妊娠鼠與對照組相比，收縮壓和尿蛋白量顯著升高，說明該模型制備成功。此外，胎盤和腎臟有明顯的結構異常，如子宮血管壁增厚，交界處有炎性白細胞浸潤，腎小球內皮增生等[52,53]。該方法證實了胎盤早期給予糖皮質激素可以誘發PE的發生，產生一系列典型的PE癥狀。但是該方法可導致胎盤和胎鼠體質量降低，其胎兒死亡率也顯著提升，這提示胎盤和胎鼠宮內生長受到限制。

3 手術干預法

3.1 動脈結扎

3.1.1 模型復制方法 早在1940年, Ogden等[54]就嘗試通過動脈結扎誘導血壓升高的方法, 他們采用部分鉗夾妊娠犬腎動脈和子宮動脈間腹主動脈的方法,使妊娠犬腹主動脈狹窄, 數分鐘后血壓升高。隨后研究者采用雙側子宮卵巢動脈狹窄及腎動脈收縮導致妊娠犬產生高血壓、蛋白尿和腎小球內皮增生等癥狀[55,56]。目前在腎動脈以下子宮動脈以上腹主動脈完全或部分結扎或者子宮動脈雙側或單側結扎的造模方法已經成功應用于家兔[57]、犬[58,59]、獼猴[60]、狒狒[61]、羊[62]、大鼠[63-66]等不同物種動物。

3.1.2 成模標準及其特點 該方法制備的動物模型會出現高血壓、蛋白尿、腎小球內皮增生等人類PE樣病理或生理改變[67]，這是判斷該模型的標準。這種采用動物手術造模的方法雖然有獨特優勢，但是模型涉及的動物，特別是靈長類動物價格昂貴、不易獲得，并且手術操作繁瑣，部分操作還受到法律和道德倫理的約束，因此該模型制備方法目前應用較少。

3.2 合體滋養細胞微絨毛膜模型

3.2.1 模型復制方法 取妊娠18 d C57BL/6小鼠，麻醉后于無菌條件下剖宮取出胎盤，制備合體滋養細胞微絨毛膜(STBM)富集沉淀，進一步制備成STBM 制劑，然后將制備的STBM 制劑稀釋至蛋白濃度為 0.14 mg/mL, 將其經尾靜脈注射妊娠10 d 的C57BL/6小鼠，即可成功制備該模型[68,69]。

3.2.2 成模標準及其特點 妊娠18 d檢測, 出現血壓、尿蛋白量顯著升高，證明模型制備成功。此外，腎臟和胎盤會出現與人類 PE 疾病的臨床及病理相似的表現，例如腎小球系膜細胞增生顯著，基底膜增厚，腎小球內紅細胞量明顯減少。胎盤蛻膜帶出現細胞水腫，進一步出現炎性細胞浸潤，迷路帶與基帶出現大量的滋養葉巨細胞增生，迷路帶局部出現纖維蛋白沉積，血供減少，甚至可以看到部分滋養細胞壞死等[68,69]。該方法構建的動物模型有助于研究 STBM 在體內的致病環節及其對主要臟器及各功能系統的影響，有助于闡明其在PE發病中的作用及相應機制等。

4 基因干預法

4.1 缺氧誘導因子1α(HIF-1α)干預

4.2.1 模型復制方法 Reshef 等[70]構建了能夠穩定持續表達HIF-1α的腺病毒(Ad-CMV-HIF), 并進一步通過尾靜脈注射將該病毒注入妊娠8 d的C57BL/6J小鼠體內，劑量為8×1010PFU，成功制備了PE小鼠模型。此外，有學者報道[71]攜帶人血管緊張素原基因(hAogen)的雌性SD大鼠與攜帶人腎素基因(hRen)的雄鼠交配可產生PE癥狀。

4.2.2 成模標準及其特點 模型小鼠妊娠17 d即可產生高血壓、蛋白尿、胎盤重量下降、腎小球硬化、胎盤病理改變等一系列人類PE關鍵表型[70]。該類方法構建的動物模型, 機制較為單一, 適合于研究相關基因在人類PE發生發展的作用研究。

4.2 基因敲除法

4.2.1 模型復制方法 基因敲除技術是目前較為活躍和成熟的分子生物學技術, 特別是TALEN、ZFN 和CRISPR/Cas等技術的發展, 極大推動了基因敲除

技術在生物醫學領域的應用。目前，已經構建的PE動物模型有COMT敲除大鼠[72-73]、ApoE基因敲除小鼠[74,75]、P57 kip2雜合子小鼠[76]等。

4.2.2 成模標準及其特點 這類模型構建成功后會產生高血壓、蛋白尿等人類PE臨床癥狀，例如COMT缺陷大鼠出現血壓上升、尿蛋白增多，腎小球損傷、胎盤形成血栓等PE樣表型。ApoE基因敲除小鼠、P57 kip2雜合子小鼠在妊娠過程中也會出現高血壓、蛋白尿、血小板計數減少等PE樣的表現。需要注意的是敲除某個基因可能會對機體其他機能產生影響，甚至可能干擾正常的PE發生發展過程，因此該類模型比較適合于揭示或者驗證某些基因對PE的影響。

5 結語

綜上所述，PE動物模型的制備為該病的發生發展等相關研究提供了良好研究材料, 目前所制備的多種動物模型各有特色, 有助于從多個角度推進PE

疾病的研究。同時, 也應該看到該動物模型制備中存在的不足, 例如化學藥物誘導法雖然研究方法較多, 但造模所用動物主要是大鼠和小鼠, 其母體子宮小動脈血管重塑與人類有一定差別[77]。犬、獼猴、狒狒、羊等大動物僅用于手術造模, 其他造模方法研究較少, 同時當前手術造模方法復雜, 成功率不高, 并且對動物損傷較大。基因干預法造模因素較為單一, 適合于研究相應的基因功能, 其應用有很大局限性。此外, 尚未見嚙齒類動物自發性PE的模型報道。這些都是制約動物模型用于PE研究的因素，因此，研究更加接近人類臨床癥狀的PE動物模型的制備方法，仍然是今后的重要課題。

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Preparation of Pre-eclampsia Animal Model

LI Dong-dong, ZHU Min, PANG Qin-xia, Ding Pei-fang
(Department of Obstetrics and Gynecology, Yangpu Hospital of Tongji University, Shanghai 200090, China)

Pre-eclampsia (PE) is a common obstetrical and gynecological disease with the hypertension, proteinuria and edema as the main clinical symptom, and accompanying with multiple organ damages. The disease is a serious threat to maternal and child safety and the leading cause of maternal and perinatal morbidity. However, the etiology and pathogenesis of PE is not clarified yet. Using animal models of PE to research human diseases is an important mean to clarify the pathogenesis of the disease or drug efficacy. There are four methods of PE animal modeling: environmental stimulation, chemical drug interference, surgical intervention and gene intervention. Rats and mice are mainly selected to prepare animal models of the PE. In addition, rabbits, dogs, rhesus monkeys, baboons and sheep are also commonly used for preparing the animal models by surgical intervention. In this paper, the preparation methods of PE animal models were reviewed, and the evaluation standards and characteristics of these animal models were introduced.

Pre-eclampsia(PE); Animal model; Preparation; Review

R711 Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0466-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.013

2016-08-08

上海市衛生局課題(No.2013SY071)

李冬冬(1987-), 女, 碩士, 研究方向: 子宮肌瘤發病機制及治療。E-mail: best_ldd@sina.com

丁佩芳, 主任醫師, 研究方向: 妊娠期高血壓的預防及治療。E-mail: d-pf18@hotmail.com