經皮冠狀動脈介入術后慢復流老年患者白細胞介素－33/ST2信號通路表達及臨床意義

藍景生　張　震羅　薇覃梓慶　趙艷英　(廣西民族醫院心血管內科，廣西　南寧　53000)

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經皮冠狀動脈介入術后慢復流老年患者白細胞介素－33/ST2信號通路表達及臨床意義

藍景生張震1羅薇1覃梓慶趙艷英(廣西民族醫院心血管內科，廣西南寧530001)

〔摘要〕目的探討經皮冠狀動脈介入( PCI)后慢復流老年患者L－33/ST2信號通路的表達及意義。方法行PCI患者210例，入院后行心電圖檢查，常規測量血壓，檢測血糖、血脂、白細胞介素( IL)－33和ST2 mRNA和蛋白測定，所有患者接受PCI治療后根據術后心肌灌注分級分為慢復流組72例和正常血流組138例，分析IL－33和ST2 mRNA和蛋白表達與老年患者PCI術后慢復流的相關性。結果①慢復流組甘油三酯( TG)、總膽固醇( TC)和低密度脂蛋白( LDL)水平均較正常復流組顯著升高( P＜0．01或P＜0．05) ;②慢復流組IL－33、ST2 mRNA和蛋白表達水平均較正常復流組顯著升高( P＜0．01) ;③多因素Logistic回歸分析顯示TG、TC、LDL、IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白是PCI術后發生慢復流的危險因素。結論IL－33和ST2表達水平升高可能導致PCI術后老年患者發生慢復流，因此IL－33/ST2信號通路可能參與PCI術后慢復流的發生。

〔關鍵詞〕經皮冠狀動脈介入; IL－33/ST2信號通路

1右江民族醫學院附屬醫院心血管內科

第一作者:藍景生( 1969－)，男，博士，主任醫師，主要從事心肌疾病炎癥反應研究。

經皮冠狀動脈介入( PCI)是治療急性心肌梗死( AMI)的主要措施之一，但是，PCI術后仍有30%～40%患者出現無復流( NR)、慢復流( SR)現象，嚴重影響患者臨床預后〔1〕。NR和SR可導致心肌梗死后更多發生充血性心力衰竭、惡性心律失常和心源性猝死等。冠心病是一種炎癥和自身免疫性疾病，其病理基礎是動脈粥樣硬化( AS)，T細胞介導的免疫應答在AS的形成過程中起著重要的作用〔2，3〕。白細胞介素( IL)－33是一種前炎性細胞因子，可與ST2受體結合而啟動IL－33/ST2信號傳導通路，可調節機體炎癥反應和免疫應答〔4，5〕。目前關于L－33/ST2信號通路與AMI老年患者PCI術后產生NR現象的相關研究較少。本文擬分析PCI術后SR患者IL－33/ST2信號通路表達及意義。

1資料與方法

1. 1一般資料2013年1月至2015年3月在本院心血管內科行PCI的210例患者，其中男116例( 55．24%)，女94例( 44．76%)，年齡60～81歲，平均( 63．67±8．64)歲。納入標準:①缺血性胸痛持續時間＞30 min，并且舌下含服硝酸甘油未緩解;②血清肌酸激酶或肌鈣蛋白升高＞正常上限2倍。排除標準:①有AMI史、冠狀動脈支架或搭橋術史的患者;②發病時間＞24 h;③對造影劑過敏的患者;④有嚴重肝腎功能障礙及凝血功能障礙的患者;⑤有急慢性感染性疾病或免疫性疾病的患者;⑥研究者認為不適于參加本研究的患者。根據PCI術后心肌灌注分級分為SR組72例和正常血流組138例，以心肌灌注分級0～1級為SR，以2～3級為正常復流。

1. 2主要試劑與儀器Trizol試劑(美國Invitrogen公司) ;兔抗人IL－33抗體( Cloud－Clone Corp公司) ;兔抗人ST2抗體(美國Abcam公司) ;辣根過氧化物酶( HRP)標記的羊抗兔IgG(北京Trans Gen公司) ; PCR試劑盒及逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR Mix(日本Taka Ra公司) ; EXL808全自動酶標儀(美國BIO－TEK公司) ; ABI 7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司) ; GeneGenius全自動凝膠成像系統(美國Syngene公司) ; KodaK4000 MM顯像系統(美國Carestream Health公司) ; 7070全自動生化分析儀(日本Hitachi公司) ; Volcano－s5血管內超聲儀(美國Volcano公司) ; IL－33、ST2和GAPDH內參引物均由上海Generay Biotech公司合成，引物序列及產物長度見表1。

表1引物序列及產物長度

1. 3治療方法所有入選患者術前檢查后，立即給予患者阿司匹林300 mg、氯吡格雷300 mg雙抗血小板治療，并且應用他汀類藥物降脂、低分子肝素鈣抗凝、硝酸酯類藥物擴冠等治療。以右橈動脈或右股動脈為穿刺入路，按照標準冠脈內支架置入術施行PCI。PCI術后均給予常規治療，嚴格臥床，持續動態心電監測，抗血小板聚集、抗凝、擴冠、降脂等治療。

1. 4檢測指標與方法所有入選患者在入院后行心電圖檢查，常規測量血壓，抽取靜脈血進行血糖、血脂等測定，并進行IL－33和ST2 mRNA和蛋白測定。

1. 4. 1血壓、血脂和血糖的測定常規水銀血壓計測量收縮壓和舒張壓，血脂測定采用日立7070全自動生化分析儀，包括總膽固醇( TC)、甘油三酯( TG)、高密度脂蛋白( HDL)、低密度脂蛋白( LDL)。

1. 4. 2 IL－33和ST2 mRNA的測定外周血RNA采用Trizol試劑提取。沉淀細胞，裂解細胞，分離、沉淀、洗滌和溶解RNA，紫外分光光度計測定總RNA的A260 nm/A280 nm，1．5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。選擇1．8～2．0并且無降解的RNA樣品按反轉錄反應體系試劑盒說明合成cDNA。在冰上配制RNA逆轉錄反應體系: Prime Script TMRT Enzyme Mix 1 μl，5×Prime ScriptTM緩沖液4 μl，OligodT Primer 1 μl，總RNA 6．0 μl，隨機引物1 μl，RNAse Freed H2O 7．0 μl，總反應體系20 μl。反應條件為37℃，15 min，再經85℃，5 s滅活反轉錄酶，獲得cDNA樣品。將cDNA產物擴增在實時熒光定量PCR儀上進行，RT－PCR反應按照試劑盒說明進行。反應條件: 95℃預變性15 min; 95℃變性30 s，62℃退火31 s，72℃延伸30 s，共40個循環。以2－ΔΔCt法計算Toll樣受體( TLR) 2和TLR4 mRNA的表達量。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，然后Gene Genius全自動凝膠成像系統中掃描分析結果。

1. 4. 3 IL－33和ST2蛋白的測定外周血加入放射免疫沉淀法( RIPA)細胞裂解液，收集細胞，離心10 min，用預冷磷酸鹽緩沖液( PBS)洗滌，超聲切割30 s后4℃2 000 r/min離心10 min，采用聚氰基丙烯酸正丁酯( BCA)法測各組蛋白濃度。用細胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與上樣緩沖液混合，煮沸10 min蛋白變性，每組取30 μg蛋白進行十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，采用脫脂奶粉封閉，一抗孵育1 h，二抗室溫孵育1 h，緩沖液洗膜3次，使用顯色試劑盒對底物進行顯色、定影。上述反應以β－actin作為內參照，結果用KodaK 4000 MM顯像系統獲取圖像并測量條帶灰度值，以目標蛋白與β－actin的比值作為各組產物相對表達值。

1. 5統計學方法采用SPSS18．0統計軟件進行t檢驗，χ2檢驗，Logistic回歸分析。

2結果

2. 1兩組臨床資料的比較兩組年齡、性別、危險因素(高血壓、糖尿病、血脂紊亂、吸煙比例)、收縮壓( SBP)、舒張壓( DBP)、血糖和HDL差異均無統計學意義( P＞0．05)，SR組TG、TC和LDL水平均較正常復流組顯著升高( P＜0．01或P＜0．05)。見表2。

2. 2兩組IL－33、ST2表達的比較SR組IL－33、ST2 mRNA和蛋白表達水平均較正常復流組顯著升高( P＜0．01)。見表3。

表2兩組臨床資料的比較〔n( %)±s〕

表2兩組臨床資料的比較〔n( %)±s〕

分組n　　性別男女年齡(歲)　　危險因素高血壓　　糖尿病　　血脂紊亂　　吸煙SR組　72　 38( 52．78)　34( 47．22)　 64．34±8．95　 33( 45．83)　16( 22．22)　45( 62．50)　19( 26．39)正常復流組138　 78( 56．52)　60( 43．48)　 63．04±7．59　 64( 46．38)　29( 21．01)　69( 50．00)　43( 31．16) t或χ2/P值　－　0．268/0．605　1．107/0．051　 0．006/0．940　 0．041/0．840　 2．979/0．084　 0．518/0．472分組　n　 SBP( mmHg)　 DBP( mmHg)　　血糖( mmol/L)　 TC( mmol/L)　 TG( mmol/L)　 LDL( mmol/L)　 HDL( mmol/L) SR組　72　 135．42±16．74　 88．60±13．70　 5．17±1．24　 4．95±1．21　 1．83±0．82　 3．34±0．82　 0．84±0．17正常復流組138　 137．74±17．53　 87．54±14．25　 5．08±1．19　 4．59±1．18　 1．52±0．75　 2．84±0．79　 0．86±0．20 t或χ2/P值　－　0．924/0．357　 0．518/0．605　 0．513/0．609　 2．080/0．039　 2．753/0．007　 4．297/0．000　 0．723/0．471

表3兩組IL-33、ST2表達的比較(±s)

表3兩組IL-33、ST2表達的比較(±s)

分組　n　IL－33ST2 mRNA　　蛋白mRNA　　蛋白SR組　72 0．84±0．12 1．14±0．24 0．59±0．08 0．79±0．11正常復流組　138 0．60±0．11 0．79±0．27 0．32±0．06 0．55±0．10 t值　　－　14．543　 9．254　 27．516　 15．947 P值　　－　0．000　 0．000　 0．000　 0．000

表4 PCI術后SR的多因素Logistic回歸分析

2. 3 SR的多因素Logistic回歸分析見表4。以PCI術后有無出現SR為因變量，將性別、年齡、高血壓比例、糖尿病比例、血脂紊亂比例、患者吸煙比例、SBP、DBP、TG、TC、HDL、LDL、血糖、IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示TG、TC、LDL、IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白是PCI術后發生SR的危險因素。

3討論

AMI是冠心病患者死亡的首要原因。AMI早期診斷和有效治療對于降低死亡率有重要的臨床意義。目前AMI主張積極、盡早進行冠脈再通治療，PCI可以縮短心肌缺血時間，降低心肌梗死面積，保護心功能，改善臨床預后。但隨著介入治療的開展，無/復流現象隨之產生，最終導致不可逆的心肌壞死和心力衰竭。冠狀動脈NR或SR現象的臨床表現取決于PCI靶血管供血心肌的范圍、患者心功能狀態及非PCI靶冠狀動脈病變的程度。近年來對“NR/SR”防治措施研究已成為國內外學者的熱點研究課題之一，PCI后發生NR是院內死亡和心肌梗死的強獨立預測因素〔6〕。冠狀動脈NR/SR現象的發生機制尚不完全清楚，但粥樣物質造成冠狀動脈遠端的微栓塞、心肌缺血再灌注損傷、毛細血管床的部分壞死及內皮功能障礙被認為是其發生的主要機制。

目前認為冠心病的發病過程也是一種炎癥反應，是在體液調節的基礎上，血液中細胞因子、趨化因子等共同作用的結果，同時也與免疫細胞的激活和失衡密切相關。IL－33屬IL－1家族，主要在基質細胞中表達〔7〕。IL－33作為一種多效應細胞因子，能夠多方面調節機體的免疫應答，其特異性受體是ST2〔8〕。ST2基因可編碼至少3種不同的亞型，當心肌細胞受到機械或炎癥刺激時，可以大量表達ST2。IL－33通過結合受體ST2后IL－33/ST2通路被激活后調節基因的轉錄，可促使Th1細胞向Th2細胞轉化，可激活多種免疫細胞，促使Th2細胞分泌IL－4、IL－5、IL－13等〔9，10〕。IL－33/ST2通路與心力衰竭的相互關系在既往的許多研究中已經證實。IL－33/ST2信號通路參與了眾多炎癥反應性疾病的發展過程，提示這種通路也有可能對AS的發生發展及冠心病的發生發展有著重要的作用。本研究顯示IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白是PCI術后發生SR的危險因素。IL－33和ST2表達水平升高可能導致PCI術后老年患者發生SR，因此IL－33/ST2信號通路可能參與PCI術后SR的發生。

4參考文獻

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〔2014－12－16修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目:廣西自然科學基金( No．0640201)

〔中圖分類號〕R541. 4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0312-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 026