三葉草的研究新進展

王亞茜，陳楠楠，林晶晶，黃俊逸，廖鮮艷（上海大學生命科學學院食品營養與功能研究室，上海200444）

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三葉草的研究新進展

王亞茜，陳楠楠，林晶晶，黃俊逸，廖鮮艷*
（上海大學生命科學學院食品營養與功能研究室，上海200444）

摘要：三葉草被認為是目前最有開發前途的保健食品和醫藥新資源之一，也是目前食品保健、生物醫學等領域的研究熱點。主要介紹了目前國內外對三葉草主要活性成分、功能及其應用等方面的研究進展，并對其進一步的開發進行了展望。

關鍵詞：三葉草；活性成分；抗氧化；抑菌

豆類是開花植物中第三大家族，對于食品工業和農業具有重要的作用。它包含727個大類和20 000個品種，三葉草屬（Trifolium）是在豆類家族中最大的種屬，有300個品種。三葉草廣泛分布于兩個半球的溫帶和亞熱帶地區[1]。三葉草又名車軸草，在我國分布廣、栽培面積大。三葉草主要分為紅三葉和白三葉。三葉草被東方和歐洲國家用于治療濕疹和牛皮癬。在土耳其民間醫藥中，一些三葉草品種比如白三葉、紅三葉，常被用于祛痰劑、鎮痛劑、防腐劑和風濕疼痛[2]。

近年來，有關三葉草的研究日益受到重視，其粗蛋白含量高，且富含黃酮類化合物、鈣、鉀、鎂、磷、維生素、煙酸等多種營養成分以及高富硒能力，成為三葉草在牧草、飼料、醫藥、保健食品等方面的開發亮點。介紹了三葉草的主要活性成分、功能及其在保健食品等方面的應用，以期為更好地開發利用三葉草提供參考。

1　三葉草中活性成分的分析

自20世紀60年代開始，人們對三葉草的活性成分及其功能與結構進行了大量研究，已從中分離鑒定了黃酮類、多糖、葉蛋白、揮發油等多類化合物，以下對幾種活性成分進行了總結。

1.1黃酮類化合物

黃酮類化合物分布廣泛，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等活性。于麗娜等[3]通過單因素及正交試驗優化了用超聲波輔助法提取紅三葉草全草中總黃酮的條件，并與醇提法進行了比較。正交試驗結果顯示，當超聲功率為250 W、超聲時間為40min、超聲溫度為70℃、溶劑濃度為60 %和料液比為1∶20（g/mL）時，紅三葉草總黃酮含量為47.52 mg/g。相比于其它的植物，章華偉等[4]采用響應曲面法優化提取桑葉黃酮工藝條件，桑葉黃酮得率為23.7 mg/g。秦學會等[5]采用響應面法優化馬齒莧黃酮的超聲輔助提取條件，在此條件下黃酮得率為8.24 mg/g。由此可見，三葉草黃酮含量比桑葉和馬齒莧黃酮含量都要高。

He等[6]從紅三葉草中分離得到金絲桃苷（Hyperoside）、異槲皮苷（Isoquercitrin）和槲皮素（Quercetin）3種黃酮化合物。Foo等[7]從白三葉草中分離得到槲皮素、楊梅素（Myricetin）、異李鼠素（Isorhamnetin）及其這3種黃酮化合物的3-O-β-D - galactopyranoside糖苷和3-O-β-D - galactopyranosides -6- O-acetyl糖苷，共9種黃酮化合物。這些活性成分為其功能的發揮奠定了基礎。

1.2活性多糖

活性多糖主要參與生物體的免疫調節，參與生命細胞的各種活動。20世紀50年代發現真菌多糖能夠活化巨噬細胞刺激抗體產生，提高人體免疫能力，具備很強的抗癌作用。

歐陽克蕙等[8]采取熱水浸提法提取白三葉草多糖，其最佳提取工藝參數為：提取時間5h，料液比1∶15（g/mL），溫度100℃，浸提液pH為9，此條件下白三葉草多糖得率為2.26 %。紅三葉草中的糖類物質主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和淀粉等[9]。

相比其它植物，王芳等[10]研究了酶處理后水提桑葉多糖為12.49 %。吳光杰等[11]利用響應曲面法對馬齒莧多糖的提取條件進行優化。在此工藝條件下，馬齒莧多糖得率達24.25 %。因此，三葉草中的活性多糖相比桑葉和馬齒莧中的多糖含量偏低。

1.3葉蛋白

葉蛋白是調節植物體內滲透壓和供給能量的重要成分，含有18種氨基酸，其中包括8種人體必需的氨基酸，且其組成比例平衡，與聯合國糧農組織推薦的成人氨基酸模式基本相符。

熊春梅等[12]以葉蛋白提取率、蛋白質量分數為指標，對三葉草葉蛋白提取的最佳工藝參數進行了優化。正交試驗表明，提取三葉草葉蛋白的最佳提取工藝為料水比1∶3（g/mL）、加鹽量為5 %、pH為3.0、絮凝溫度為70℃，含量高達14.36 mg/g。

趙國磊等[13]測得紅三葉草中蛋白質含量約為干重的113 mg/g。此外三葉草中還含有各種必需的氨基酸，葉中以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和甘氨酸8種氨基酸含量較高，花中以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸3種氨基酸含量較高[14]。

王芳等[15]采用超聲波提取桑葉葉蛋白，在最佳提取工藝下，桑葉葉蛋白含量為99.3 mg/g。高莉等[16]從馬齒莧中提取葉蛋白，在最佳提取工藝提取葉蛋白的含量為9.5 mg/g。相比之下，三葉草中的葉蛋白含量最多，這也是它成為優質飼料的原因之一。

1.4葉綠素

葉綠素是一種天然色素，富含微量元素鐵，是天然的造血原料，而且能有效預防感染，防止炎癥的擴散。張志強等[17]用有機溶劑萃取法提取白三葉干草中葉綠素，通過對影響提取效率的各參數進行正交試驗得出葉粉的最佳提取工藝為：用95 %乙醇按照1∶15（g/mL）的料液比于60℃恒溫水浴中加熱1 h，最佳提取條件下葉綠素的含量為70.35 mg/g。

曾家豫等[18]以紅三葉鮮青草預加工廢水為原料，研究了葉綠素的提取方法。首先，采用醇沉法沉降紅三葉預加工廢水中的有機物；其次，采用醇提法浸提沉淀物中的葉綠素，并通過單因素及正交實驗對提取條件進行了優化。結果顯示，從廢水中沉降有機物的最佳乙醇濃度為30 %，固形物沉降率為39.45 %；從沉淀物中浸提葉綠素的最佳條件為乙醇濃度90 %、浸提溫度60℃、浸提時間6 h和料液比1∶25（g/mL），葉綠素含量為1.72 mg/g。

陳紹瑗等[19]在最佳提取條件下獲得桑葉葉綠素的含量為5.376 mg/g。相比之下，三葉草中的葉綠素含量要高于桑葉中的葉綠素含量。

1.5綠原酸

綠原酸具有多種藥理作用，是許多中藥材及中成藥中起抗菌、消炎、解毒、利膽、降壓、抗腫瘤、抗氧化和抗衰老的功效成分[20]。趙瑩等[21]提取白三葉草中的綠原酸，并用高效液相色譜測定其中含量為7.46 mg/g，表明白三葉也是一種可開發的植物資源。戴開金等[22]用甲醇為提取劑，40min超聲提取2次測定桑葉中綠原酸含量為2.05 mg/g，比三葉草中綠原酸含量略低。

1.6揮發性活性成分

許多植物的揮發性油用作精油的生產，其用途也非常廣泛。不僅可以用于皮膚的殺菌、消炎，還具有降血壓、祛痰、鎮痙等作用。景書灝[23]以白三葉草為研究對象，提取了白三葉草的揮發油成分并進行GC-MS分析，并進行了抗菌活性測定和體外抗結核桿菌試驗。試驗結果表明，白三葉的揮發油成分具有抗細菌、真菌作用，并對結核桿菌有一定的抑制作用。白三葉中揮發性成分十分豐富，但我國對其揮發性物質的研究還處于探索階段，有待進一步深入研究并開發出以其揮發性物質為主要成分的新產品。

2　三葉草的功能研究

2.1抗氧化功能

黃酮類物質是強抗氧化劑，是自由基的強清除劑。紅三葉中的異黃酮和多酚化合物被認為是有效的抗氧化劑、自由基清除劑和功能食品增補劑，具有良好的生理健康促進作用[24-25]。

劉寶劍[26]對紅三葉總黃酮抗氧化作用及其對免疫功能的影響研究發現，紅三葉總黃酮能明顯抑制過氧化氫誘導的紅細胞溶血反應，且隨著紅三葉總黃酮濃度增加，其抑制作用逐漸增加。說明紅三葉總黃酮在一定濃度范圍內有抗氧化、抑制溶血的作用。楊麗珍等[27]研究發現紅三葉黃酮通過提高衰老大鼠SOD（超氧化物歧化酶）活性，降低MDA（丙二醛）濃度，達到提高機體清除氧自由基能力，從而有效延緩衰老。

2.2富硒功能

硒是構成酶的活性成分，參與酶的催化反應；調節維生素的消化吸收；參與電子傳遞，調節機體代謝；抗氧化和清除自由基的功能；調節機體免疫力；影響人和動物的繁殖發育等。作為植物有機硒，其生物活性遠遠大于亞硒酸鈉等無機硒[28]，三葉草因體內含有較高有機硒，因此具有了微量元素硒的部分生物學功能。

楊三東等[29]研究發現紅三葉草是一種高富硒植物，經高硒栽培或生長于高硒地區的紅三葉草含硒量可達15 μg/g左右，蛋白質、多糖和核酸結合硒是微量元素硒在紅三葉體內的主要賦存形態，占總硒量的80 %以上，其中蛋白質硒占總硒的1/2以上。

2.3抑菌功能

石靖等[30]從三葉草等葉片中提取揮發性有機物，用菌落法和濾紙片法研究其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用。結果發現三葉草葉片釋放的揮發性有機物對3種細菌都有抑菌作用，且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌率分別達到了37.7 % 和11.3 %，但其抑菌物質的種類和性質等有待進一步探討。

2.4營養（飼料）功能

譚劍蓉等[31]研究了不同比例的白三葉草粉對肉兔生長性能、消化代謝、屠宰性能、血液指標、消化酶活性、腸組織形態和盲腸內環境等方面的影響，結果表明在肉兔日糧中添加40 %的白三葉草粉，其營養物質的消化率最高，消化酶的活性最高。可見，三葉草粉對肉兔的生產性能和消化生理功能都是有利的。

四川農業大學把白三葉加入奶牛的日糧中以取代粗飼料，3 d即可提高0.87 %的產奶量，使凈收益增加23.7 %～34.6 %。在禾本科牧草與白三葉混播的草地上放牧奶牛時，不但可以改善其健康和提高產奶量，犢牛斷奶后還能夠獲得較高的日增重和受胎率，也可以相對減少產后癱瘓疾病[32]。給反芻動物飼喂紅三葉草會提高多不飽和脂肪酸（PUFA）的含量，降低飽和脂肪酸的含量[33]。白三葉草地用于飼喂蛋雞，可提高產蛋量和增加蛋黃色澤[34]，而且可有效節省糧食資源，緩解糧食危機。

2.5醫藥與保健功能

三葉草中的三萜皂苷有廣泛的生物學性質，比如殺釘螺活性、抗炎、抗菌、免疫溶血、細胞毒性和抗腫瘤[35]。皂苷被廣泛用于食品和飼料添加劑，對人體和動物的健康有益。

紅三葉草異黃酮為植物雌激素，其結構類似于17-β-雌二醇，因此異黃酮能夠連接雌激素受體（ERs），起到激素的作用[36]。人體補充紅三葉草異黃酮可以預防和治療激素分泌失調導致的一系列相關疾病。絕經后的婦女補充紅三葉草異黃酮可以顯著減輕更年期癥狀，并且對甘油三酯的水平有積極的影響[37]。Sabudak等[38]用異黃酮和雌二醇來抑制或預防婦女由于內源性雌激素減少而引起或加重的一些疾病。另外，紅三葉草也能治療雌激素病，如子宮肌瘤、子宮內膜異位及骨質疏松癥等[39]。

植物來源的多糖對腸道健康有積極的作用，三葉草來源的多糖可以通過阻止腸道菌落的減少和降低疾病活性指數來抑制葡聚糖硫酸鈉引起的小鼠結腸炎[40]。

3　應用與開發

3.1功能食品的研發

3.1.1主食品的開發

三葉草中富含粗蛋白、維生素和葉黃素，不含動物蛋白所含的膽固醇，可作為兒童和成人的食用蛋白源和食品添加劑[41]，被聯合國糧食及農業組織認為是一種高質量食品，因此，應該加大開發力度。關于植物葉蛋白研究報道較多，鄭建仙[42]將苜蓿葉蛋白應用到面條中，在添加量不超過4 %時，不改變面團流變學特性和口感；即使苜蓿葉蛋白的加入量達5 %，也不會影響面條的加工性能。三葉草葉蛋白與苜蓿葉蛋白都屬于植物蛋白，同動物蛋白相比，植物葉蛋白成本低廉，在經濟欠發達地區是一種理想的食品。葉蛋白對人體具有多種功能，它進入人們的膳食結構后，將會降低高膽固醇對健康的危害。

3.1.2副食品的開發

朱成凱等[43]以三葉草浸提液為主要原料，在配方優化的基礎上，研制具有抗氧化及改善睡眠等保健功效的功能性飲料。該飲料有濃郁的三葉草清香，口感清爽，是一款有開發前景的功能性飲料。

夏詠梅等[44]將桑葉粉代替綠茶粉應用于抹茶蛋糕中，生產的抹茶蛋糕色澤鮮艷翠綠，甜度適中，茶香馥郁細膩。而且桑葉富含多種礦物質和氨基酸，具有降血壓、調節血脂、延緩衰老、抑菌、美容等功效，已經被認定為“藥食同源”的農產品，而且抑菌功效可以延長蛋糕貨架期。

唐長波等[45]通過單因素試驗和正交試驗探討桑葉保健餅干配方及生產工藝，確定桑葉保健餅干最佳配方。該配方生產的餅干呈均勻淡綠色、外形完整不變形、結構細密、口感酥松爽口并賦有桑葉特有清香，而且具有良好的營養和保健價值。有關三葉草在副產品上的開發較少，但是桑葉的開發利用可以為三葉草的開發提供一些借鑒，因而三葉草開發前景廣闊。

3.2飼料添加劑的開發

白三葉是世界上分布最廣的一種豆科牧草，初花期干物質粗蛋白含量高達24.7 %，纖維含量相對低于禾本科，礦物含量高于禾本科，富含氨基酸和多種維生素（VB、VC、VE、VK），具有高度易消化性、營養性及適口性[46]。

三葉草中含有豐富的葉蛋白，是豬、雞、牛、羊良好的蛋白質補充飼料，對家畜適口性好、營養價值高、明顯增加體重以及改善禽、畜、魚、蛋等產品品質，具有良好的飼養效果，可作為家畜飼料添加劑，也可直接制成葉蛋白飼料直接進行飼喂。

3.3保鮮作用的應用

由于可能的毒副作用，苯甲酸鈉和山梨酸鉀等合成防腐劑已有逐漸被淘汰的趨勢，而三葉草作為天然食品防腐劑的作用將使它具有較好的開發前景[47]。三葉草中的揮發性有機物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較強的抑菌作用，因此可以開發作為天然食品防腐劑而加以開發與應用[48]。徐娜婷等[49]研究了楓香葉揮發油對枯草桿菌等的抑制作用，并將楓香葉揮發油應用于枇杷保鮮。結果表明，楓香葉揮發油對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霉菌均有抑制作用，并有利于枇杷保鮮。因此，三葉草也可采用同樣方法。

3.4醫藥與保健功能的應用

三葉草中含有豐富的異黃酮、皂苷、多酚類化合物及活性多糖等功能性成份。市場上已出現了很多植物來源的保健品，如大豆異黃酮、人參皂苷Rh2膠囊、茶多酚膠囊、靈芝多糖膠囊等。目前，關于三葉草中的活性成分的功能與應用研究也越來越受到人們的關注，具有良好的市場潛力。

4　展望

隨著人們對三葉草及其活性成分生理功能研究的不斷深入，其應用領域將不斷擴大。目前有關三葉草的應用主要集中在牧草、飼料、環境綠化等方面的初步應用，有待進一步深入。三葉草資源在我國十分豐富，應加強對其活性成分的開發利用，充分利用好三葉草豐富的黃酮和有機硒資源，研發出對人體有利的功能食品。三葉草硒化合物在人和動物補硒方面的應用研究、如何更好地利用三葉草中的活性成分等等，都是目前我們需要解決的問題，這將為我們研究開發出更多的以三葉草活性成分為原料的保健食品和醫藥產品提供理論和試驗參考，產生良好的社會效益和經濟效益。

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The New Research of Trifolium

WANG Ya-xi，CHEN Nan-nan，LIN Jing-jing，HUANG Jun-yi，LIAO Xian-yan*
（Laboratory of Food Nutrition and Function of School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444，China）

Abstract：Trifolium is considered to be the most promising health food and medicine，which are also hotpots in the field of food health care and biological medicine，etc.This article summarized the research progress on the main active components and pharmacological action of trifolium，reviewed its applications in health food and pharmaceutical，and forecast its further application as well.

Key words：trifolium；active components；antioxidant；antibacterial

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.046

基金項目：大學生創新項目（上海大學）

作者簡介：王亞茜（1990—），女（漢），碩士，研究方向：食品科學。*通信作者：廖鮮艷（1975—），女，副教授。

收稿日期：2014-10-21