ELISA試驗中常出現的問題及解決方法

吳召坤 鞏雪英 劉粉紅/陜西省丹鳳縣畜牧獸醫中心

ELISA試驗中常出現的問題及解決方法

吳召坤 鞏雪英 劉粉紅/陜西省丹鳳縣畜牧獸醫中心

ELISA試驗，即酶聯免疫吸附試驗，具有敏感性高的特點，獸醫實驗實常用ELISA試驗檢測樣品的抗原或抗體，ELISA試驗中很多因素都會影響試驗的結果，試驗中常出現的有顯色淡，靈敏度偏低、樣品重復試驗差異大、假陽性和假陰性等。這些都會使我們對樣品的真實結果做出誤判，現就ELISA試驗中非正常檢測結果產生的原因進行分析，尋討其解決的辦法，以提高檢測的準確性。

一、顯色淡，靈敏度低

1.查看試劑盒是否在有效期內，是否按照保存溫度保存。試劑盒過期或保存溫度過高（正常保存溫度2℃～8℃）都會影響顯色。

2.試劑盒從2℃～8℃冰箱取出后在室溫平衡至少20～30 min。

3.溫育時間不足或培養箱溫度不足37℃，在ELISA試驗中一定要注意溫育時間和溫度的重要性，在溫育的過程中盡量不要打開溫箱，僻免溫度忽上忽下。溫育時間不足，溫度過低都會影響顯色。

4.嚴格按照試劑說明書要求的洗滌方法洗滌，洗滌時加洗滌液不能沖擊過大，浸泡時間過長，要按照說明書上要求的洗滌次數洗滌。

5.加樣不足，加樣時要按照加樣量調整好移液器的刻度，使用配套，內壁光滑清潔的吸頭，吸頭不能交叉使用，同時要對移液器進行校準，僻免加樣不足使顯色不足。

6.配制洗滌液的水要用純水機過濾的水，水質應清潔無異常，不能用酸性過大或堿性過大的水，最好用新鮮合格的蒸餾水。

二、樣品重復試驗差異較大

在檢測過程中有時同一樣品兩次檢測結果不一樣，差異較大，這種情況可能存在以下幾種原因。

1.兩次檢測樣品數量可能不同，加樣時間長短不一，反應時間長短不一，所以重復檢測某一樣品時，盡量與第一次加樣時間一致。

2.加樣量不一致，樣品稀釋倍數要準確，充分混勻，兩次加樣要使用同一個移液器。

3.溫育時間和溫度不一致，洗滌及操作人員不一致。重復檢測樣品，操作條件，人員等檢測過程應與上次保持一致。

三、假陽性和假陰性

（一）樣品的采集和保存

1.樣品應清亮、透明、新鮮、無溶血，樣品溶血后血清樣品中的血紅蛋白可造成假陽性。

2.樣品被細菌污染，菌體中的某些物質會產生假陽性反應。

3.僻免樣品反復凍融。

4.樣品不清亮，樣品里有可見的纖維蛋白絮狀物，易造成假陽性。因而分離血清時應待血液完全凝固，血清自然析出，在分離出合格血清。

（二）加樣

1.樣品的稀釋要按照試劑說明書上規定的稀釋倍數稀釋血清，避免血清中的非特異性IgG過多，這些非特異性IgG與酶標二抗反應極易出現假陽性

2.如果加入的酶結合物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。

（三）溫育

在做ELISA試驗時，一定要按照溫育的時間和溫度進行，溫育的時間和溫度的改變都會對反應有影響，因而：

1.溫育時間過短，溫度過低，易致顯色不全。溫育時間過長，溫度過高，易致非特異結合物緊附于反應孔周圍，難以清洗徹底，產生陰性高值或假陽性反應，因而在溫育時要嚴格按照規定的溫度和時間進行溫育。

2.將反應板放入恒溫箱時，反應板不能疊放，以保證反應板受熱均勻，溫度能迅速達到平衡。

四、洗板

1.要按照試劑說明書上的說明配制好洗滌液，配制洗滌液用水最好為新鮮的蒸餾水，配制倍數準確。

2.洗板時要按照試劑說明書上的洗滌方法洗滌，不能隨意改變洗滌方法，洗滌時間，洗滌次數。

3.不同廠家，不同批次試劑的洗滌液不能混用。

4.配制洗滌液用水的質量很重要，關系試驗成敗，準確與否，洗滌用水最好用新鮮合格的蒸餾水。

五、OD值測定

顯色完成，加終止液后將反應板放入酶標儀檢測OD值。

1.在反應結束前應將酶標儀開啟，預熱10～20 min，儀器放置應平穩，保證儀器運轉正常。

2.按照試劑說明書要求調整好酶標儀的檢測波長。

3.顯色結束加終止液后，應盡快測定OD值，一般在10 min內測定。

4.酶標儀不用時應放置在干燥、干凈的儀器室，加蓋防塵罩，同時應定期對酶標儀進行效驗，確保儀器運轉正常，精確。