紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus）精巢發育的組織學研究

劉　皓，劉　麗，劉楚吾，羅　杰

（廣東海洋大學水產學院//南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室　廣東 湛江 524025）

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紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus）精巢發育的組織學研究

劉皓，劉麗，劉楚吾，羅杰

（廣東海洋大學水產學院//南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室廣東 湛江 524025）

摘要：為掌握紅鰭笛鯛的繁殖特性，通過石蠟切片、蘇木精-伊紅染色對紅笛鯛精巢的發育進行組織學研究。結果表明，紅鰭笛鯛的精巢屬于葉狀精巢，精子發生過程與其他脊椎動物一樣，包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細、精子細胞和精子形成。精巢的生長發育過程的組織學結構共分為5期：3～4月齡精巢為第Ⅰ期精巢，精原細胞無定向分散在結締組織之間；5～6月齡精巢為第Ⅱ期精巢，精原細胞成束分布，形成曲細精管的雛形；6～9月齡精巢為第Ⅲ期精巢，曲細精管出現管腔，曲細精管的管壁由精原細胞和大量初級精母細胞和次級精母細胞及少數精子細胞構成；10月齡精巢為第Ⅳ期精巢，曲細精管內除了精原細胞和初級精母細胞外、還形成了次級精母細胞和精子細胞，同時，管腔中出現極少量的精子；16月齡精巢為第Ⅴ期精巢，外觀呈橢圓形的圓柱狀，曲細精管的管腔和壺腹中充滿成熟的精子。

關鍵詞：紅鰭笛鯛；性腺發育；精巢；組織學

紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus）的分類地位屬于硬骨魚綱、鱸形目、笛鯛科、笛鯛屬，為暖水性近底層魚類，生存溫度范圍為2～34℃，最適生長溫度范圍為25～30℃，適應鹽度為5～40，最適鹽度為20～30，分布范圍廣，在我國主要產于東海南部和南海，是南海重要經濟魚類之一。其個體較大，肉質豐厚堅實，富含蛋白質和脂肪，生長迅速，產量高，經濟效益顯著。近年來，對其研究主要集中在繁殖技術、養殖技術、遺傳學和生理生化等方面[1-3]，有關紅鰭笛鯛精巢發育的研究很少，僅見楊春玲等[4]用組織學方法對1.5～2.5齡紅鰭笛鯛的性腺發育報道。本研究對紅鰭笛鯛精巢發育進行組織學研究，以期掌握紅鰭笛鯛精巢發育的過程及周期變化、各發育時期雄性生殖細胞的細胞學特點，了解其繁殖性能，進一步開發、利用和保護好這一優良種質資源，并且進一步豐富魚類繁殖生物學的內容。

1　材料和方法

養殖紅鰭笛鯛由湛江海康流沙灣魚排提供，從2012年9月至2015年8月，1齡以內，每1～2個月取材一次，1齡以上，每3～6個月取材一次，每次取材5～10尾。帶回實驗室后測量體長，稱取質量后解剖取出精巢稱重后，參照鄭國锠《生物顯微技術》[5]，將性腺用Bouin’s液固定，取部分精巢在室溫下作連續切片，切片厚度6～8μm，蘇木精.伊紅染色，Leica DM 6000 B生物顯微鏡觀察、攝影。

2　結果

2.1雄性生殖細胞發育過程及其形態特征

紅鰭笛鯛的精子發生過程與其它脊椎動物一樣，從精原細胞生長發育，分化成為初級精母細胞，而初級精母細胞經過兩次成熟分裂形成次級精母細胞和精子細胞，精子細胞再經過變態而成為成熟的精子。

2.1.1精原細胞（Spermatogonia）精原細胞由原始生殖細胞（Primordial germ cell）分化而來。常位于曲細精管內靠近基膜的部位，體積較大，呈圓形或卵圓形，平均直徑7 μm左右；細胞核大而清晰，位于細胞中央，核徑4 μm左右。精原細胞染色相對較淺，但隨著發育，嗜堿性逐漸增加（圖1-2）。

2.1.2初級精母細胞（Primary spermatocyte）經過增殖后，部分精原細胞停止有絲分裂而分化、生長形成初級精母細胞。初級精母細胞一般分布于精原細胞以內，細胞為圓形或橢圓形，體積比精原細胞小，平均直徑為5.0 μm左右，細胞質少，為嫌色性。細胞核染色深，核直徑平均約為3.5 μm左右（圖3）。

2.1.3次級精母細胞（Secondary spermatocyte）通過第一次成熟分裂，一個初級精母細胞形成兩個次級精母細胞。由于分裂后體積基本沒長大，因此，次級精母細胞的細胞質進一步減少從而使細胞體積比初級精母細胞變小，細胞直徑平均為4 μm左右，細胞核的嗜堿性進一步增強（圖3）。次級精母細胞在精子的整個發生過程中存在的時間比較短暫，很快進行第二次成熟分裂。

2.1.4精子細胞（Spermatid）經過第二次成熟分裂后，一個次級精母細胞分裂為兩個精子細胞。精子細胞呈圓形，其體積更小，平均直徑2.5 μm左右，在切片中只能見到一個染色很深的細胞核，見不到明顯的細胞質。細胞核染色更深,在光鏡下呈強嗜堿性（圖5）。

2.1.5精子（Spermatozoa）由精子細胞經過高度濃縮，丟棄了大部分細胞質后變態而成精子，所以它是精巢中最小的一種細胞，嗜堿性極強,染成深藍色。精子在切片中成群分布在曲細精管腔中（圖7-9）。

2.2精巢發育分期及其組織學結構

紅鰭笛鯛魚的精巢結構與鯉科、鯡科和鮭科等絕大多數魚類相類似，都是屬于葉狀精巢。成熟精巢內部由許多排列不規則的曲細精管（seminiferous tubles）組成。曲細精管與曲細精管之間充滿間質細胞、成纖維細胞、血管和淋巴管。曲細精管由雄性生殖細胞、支持細胞（sertoli cell）及排列在管周的類肌細胞（myoid cell）組成。

2.2.1Ⅰ期精巢3～4月齡精巢，呈透明的細線狀，位于鰾腹兩側，包被在大量的脂肪之中，肉眼無法分辨出雌雄。切片觀察，可見到很多無定向排列的精原細胞分散在結締組織之間，為精原細胞的增殖期，曲細精管尚未形成。（圖1）

圖1　第Ⅰ期精巢Fig.1　Testis in the stage Ⅰ

2.2.2Ⅱ期精巢5～6月齡精巢，呈細帶狀，乳白色，半透明，表面血管不發達。精巢中有許多體積大的精原細胞，核很大。精原細胞已開始定向排列，并且成束分布，這些成束排列的精原細胞中穿插支持細胞，其外有類肌細胞排列而形成的膜，實為曲細精管的雛形。曲細精管與曲細精管之間充滿間質細胞、成纖維細胞、血管和淋巴管（圖2）。

圖2　第Ⅱ期精巢Fig.2　Testis in the stage Ⅱ

2.2.3Ⅲ期精巢6～9月齡精巢，稍呈圓柱狀,血管分布增多,外表呈現弱紅色。曲細精管出現管腔。在一個曲細精管的橫斷面內,除少數的精原細胞外,大都是同型的初級精母細胞和次級精母細胞，也有少數精子細胞（圖3）。第一個性周期內，Ⅲ期精巢由Ⅱ期精巢發展而來。

圖3　第Ⅲ期精巢，Fig.3　Testis in the stage Ⅲ

2.2.4Ⅳ期精巢10月齡精巢，外觀呈橢圓狀，表面有發達的微血管分布。此期精巢的曲細精管內除了處于邊緣的精原細胞以外，也有初級精母細胞、次級精母細胞以及精子細胞；同時，曲細精管的管腔中還出現極少量的精子，每個曲細精管的橫切面內的生精細胞往往同型的細胞群成團排列，并且基本處于同一發育水平（圖4—7）。

2.2.5Ⅴ期精巢16月齡精巢，其外觀呈橢圓形的圓柱狀，乳白色,表面血管更加明顯。曲細精管的管腔和精巢壺腹中充滿成熟的精子。曲細精管壁除了精原細胞外，主要由正在變態的精子細胞及精子組成，也有少量初級精母細胞和次級精母細胞（圖8、9）。

圖4　第Ⅳ期精巢Fig.4　Testis in the stage Ⅳ

圖5　第Ⅳ期精巢（圖4）局部Fig.5 The magnification of testis in the stage Ⅳ(figure 4)

圖6　第Ⅳ期精巢（圖4）局部Fig.6　The magnification of testis in the stage Ⅳ(figure 4)

圖7　第Ⅳ期精巢（圖4）局部Fig.7　The magnification of testis in the stage Ⅳ(figure 4)

圖8　第Ⅴ期精巢Fig.8　Testis in the stage Ⅴ

圖9　第Ⅴ期精巢（圖8）局部Fig.9　The magnification of testis in the stage Ⅴ(figure 8)

2.3第一個性周期內不同年齡（月齡）紅鰭笛鯛精巢發育的組織學特征

紅鰭笛鯛3～4月齡精巢發育到第Ⅰ期，為精原細胞的增殖期，曲細精管尚未形成（圖1）。5～6月齡精巢為Ⅱ期，精原細胞已開始定向排列，并是成束分布，實為曲細精管的雛形（圖2）。6～9月齡精巢為第Ⅲ期，曲細精管出現管腔。在一個曲細精管的橫斷面內,除少數的精原細胞外,大都是同型的初級精母細胞（圖3）。10月齡的精巢已經發育到第Ⅳ期，精巢切片中，生精上皮從精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞到精子細胞各個等級的生精細胞都存在，在曲細精管的腔中還可見到極少數的精子（圖4）。16月齡的紅鰭笛鯛精巢已發育到第Ⅴ期精巢的滿熟階段，在精巢的壺腹中和曲細精管的腔中充滿了成熟的精子，曲細精管的生精上皮除了較多的精原細胞外，還包含有少量初級精母細胞以及次級精母細胞和精子細胞等不同發育時期的雄性生殖細胞（圖8、9）。

3　討論

根據精巢內生殖細胞的分布及精巢組織的分化情況,硬骨魚類的精巢結構可分為管狀型(Tubular type)和葉狀型(Lobular type)2 種類型[6-15]。大多數硬骨魚類屬于葉狀型精巢,結締組織向內分隔形成許多精小葉（精小管），每個精小管又包含著若干精小囊，葉狀精巢中其精原細胞在精小管的所有部位的邊緣都可存在，在分化過程中，同一發育時期的生精細胞在精小囊中生長發育。隨著雄性生殖細胞的發育和精子的形成過程,小囊逐漸向中央腔移動,靠近中央腔的小囊把成熟的精子釋放到中央腔內，中央腔與輸精管相通。少數魚類的精巢屬于管狀型精巢，例如銀漢魚目（Atheriniformes）的某些種類[6]，青鳉科魚類（青鳉Oryzias latipes）[9]，鱸形目金錢魚科的金錢魚(Scatophagus argus)[15]等。管狀精巢中，只有在精小管的盲端才有精原細胞，隨著發育和分化，精小囊向輸出管的方向遷移，因此，只在靠近輸出管的部位才存在成熟的精子。但根據崔丹等[15]的報道，金錢魚的成熟精子不僅存在于靠近輸出管的部位，在Ⅳ期精巢精小管的管腔中也有成熟精子存在。在精小囊遷移過程中，其中的精子細胞變態為成熟精子，此時精小囊便破裂，從而使精子釋放入管腔中。這說明金錢魚的管狀精巢與典型的管狀精巢不完全相同。根據本研究，紅鰭笛鯛精巢符合于上述葉狀型精巢的特征，因此應屬于典型的葉狀型精巢。

魚類精原細胞發育成為成熟的精子的整個過程與哺乳動物相類似，一般不區分時相，而是按發育過程序直接稱呼。依次分為精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子5個發育階段[9,12,16-26]。但是，不同的研究者對其發育過程的劃分也有一些差異，有的研究者對各發育階段的命名和定義都有些變化，例如將大彈涂魚生精細胞的發育分為精原細胞期、精原細胞增殖期、精母細胞生長成熟期、精子細胞變態期、精子成熟期和退化吸收期[14-15]；有的研究者將精原細胞階段細分為初級精原細胞、次級精原細胞[27]或者A 型精原細胞和B型精原細胞[9-10,20,28-29]。精巢內存在兩種精原細胞，這與其他動物睪丸的情況類似，即其中一種精原細胞作為干細胞，它繼續進行有絲分裂，維持精巢內的精原細胞數量，不發生進一步分化；而另一種精原細胞則分化為精母細胞[18]。本研究將紅鰭笛鯛生精細胞的整個發育過程按其發育順序分為精原細胞期、初級精母細胞期、次級精母細胞期、精子細胞期及精子形成5個階段，沒有將各階段再進一步細分。

大多數學者根據其相應的組織學成份，將魚類的精巢分為6個時期[9,21,24,26,30-31]：Ⅰ期精巢、Ⅱ期精巢、Ⅲ期精巢、Ⅳ期精巢、Ⅴ期精巢和Ⅵ期精巢。除了有的研究在名稱上有細微的差異外[11,14]，分期的方法基本一致。但在不同種類同一時期精巢的精小管中各類生精細胞的比例不同，發育程度也有差異，表現出同步或非同步發育，可能與其產卵類型有關。屬一年一次產卵的魚類它們的生精細胞發育比較同步,如草魚[16]，甚至在同一精小管中的生殖細胞處于同一發育階段，如紅鳙魚[32]等。本研究將紅鰭笛鯛的精巢分為5個時期（不包括退化期），其Ⅰ期和Ⅱ期的精巢主要是精原細胞，同步性較好。Ⅰ期精巢精原細胞無定向排列，Ⅱ期精巢精原細胞成束分布，形成精小管的雛形。Ⅲ期精巢的精小管中除了邊緣的精原細胞外,大都是同型成簇排列的初級精母細胞和次級精母細胞，也有少數精子細胞，發育不同步。Ⅳ期精巢精小管中出現了部分精子，Ⅴ期精巢中除了精小管壁存在各級生精細胞外，精小管腔和壺腹中充滿成熟的精子。在Ⅲ期及以后精巢中，多級生精細胞同時存在，表明紅鰭笛鯛精巢具有持續產生精子的能力，屬于分批成熟排放（多次產卵）的類型。與條斑星鰈、圓斑星鰈、牙鲆及條石鯛等魚類相似[21,23,30]。

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（責任編輯：陳莊）

Histology of Testis Development of Red Snapper,Lutjanus erythopterus

LIU Hao,LIU Li,LIU Chu-wu，LUO Jie
(Fisheries College，Guangdong Ocean University//Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong Higher Education InstitutesZhanjiang 524025,China)

Abstract：In order to understand fish reproductive performance and provide the reference for the artificial propagation and breeding,the current study,investigted the testis development of red snapper(Lutjanus erythopterus)based on the technology of paraffin section and hematoxylin-eosin staining.The results showed that red snapper testis are lobular type,and the process of the spermatogenesis were consisted of five periods including spermatogonium,primary spermatocyte,secondary spermatocyte,and spermatid．The process of spermiogenesis refined the differentiation of spermatid into sperm.According to the histological structure,the testis development was divided into 5 stages.Testis Stage 1 was happened on 3～4 months,which the spermatogonia dispersed among the connective tissue cells.Testis stage 2 was happened on 5～6 months,which the spermatogonia distributed in the testis in clusters and the clustered spermatogonia were the initially seminiferous tubules.Testis stage 3 was happened on 6～9 months,which the seminiferous tubules appeared lumen and the seminiferous epithelia were composed of the same type of primary spermatocytes and secondary spermatocytes,besides spermatogonia.Testis stage 4 was happened on 10 months,which the seminiferous epithelia werebook=2,ebook=5composed of primary spermatocytes,secondary spermatocytes,spermatids,besides spermatogonia at the outer edge of the seminiferous tubules and a very small amount of sperm in the lumen.Testis stage 5 was happened on 16 months,which the seminiferous tubules lumen and ampule of deferent duct were filled with mature spermatozoa.

Key words：Lutjanus erythopterus；gonad development；testis；histology

通信作者：羅杰(1966—),碩士,教授級高工,主要從事水產經濟動物人工繁育與增養殖技術研究。E-mail:luoj@gdou.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金項目（31101904）；湛江市科技計劃項目（2015B01074）

收稿日期：2015-09-16

doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.001

中圖分類號：S965.399；Q579.1

文獻標志碼：A

文章編號：1673-9159（2015）06-0001-06

第一作者：劉皓（1981—）,男 ,實驗師,碩士,主要從事水產經濟動物發育生物學研究。E-mail:liuh@gdou.edu.cn