肝癌特異癌胚性抗原介導的免疫治療研究*

姚敏,姚登福

（南通大學:1醫學院免疫學教研室；2附屬醫院臨床醫學研究中心，江蘇南通226001）

·肝病專欄·

肝癌特異癌胚性抗原介導的免疫治療研究*

姚敏1,姚登福2

（南通大學:1醫學院免疫學教研室；2附屬醫院臨床醫學研究中心，江蘇南通226001）

肝細胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的預防和有效治療仍是醫學界的難題[1-2]。人類HCC發生與肝炎病毒(HBV、HCV)慢性持續性感染、化學致癌物攝入等多病因作用相關。癌基因或癌相關基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些癌基因重新復活等諸多因素，引起肝細胞生長失控，經啟動、促進、演變為多階段發病過程。因其惡性度高，起病隱匿，早期診斷率低，確診時往往已到中晚期，失去根治性切除機會，且術后復發機率很高，預后極差[3]。肝癌以手術切除為主的綜合治療，包括血管栓塞、射頻、放化療和生物治療等，雖可有效地治療局部病灶，但仍不能解決復發、轉移等問題[4-5]。肝癌特異性或相關抗原、某些通路的關鍵信號分子、生長因子及受體和癌基因產物等均為治療靶點，癌胚型抗原介導的治療靶點具有高度靶向特異性，在肝癌治療中可能具有良好的應用前景。本文述評了近年對癌胚型抗原介導的肝癌分子免疫治療研究的新進展。

1 癌胚性HBx抗原與肝癌免疫治療

肝癌為多基因變異的惡性腫瘤，伴隨DNA甲基化改變、MicroRNA、lncRNA表達及免疫應答等[7-8]。我國肝癌患者中HBV感染者居多，在80%以上。HBV感染自然史分為免疫耐受期、免疫清除期、非活動復制期和再活動期，免疫力低下或勞累可誘導基因變異[9-10]。在HBV的A、B、C、D、E、F、G和H 8種基因型中，我國肝癌患者以C型和B型為主；C基因型占74.5%，尤其C2亞型比B基因型更易致癌，且術后又是復發的高危因素，值得重視[11-12]。HBV陽性肝癌中存在大量截短HBx蛋白為致癌基因，肝癌細胞基因組19q12、2q32.2、22q12是HBx整合位點。將HBx基因轉染至肝癌HepG2細胞，受轉染細胞第3、18和20號染色體發生改變，微核數量增加3倍；HBx蛋白調節胞內基因、結合轉錄因子、激活相關信號通路與啟動子共同作用，誘導肝細胞發生惡性轉化[13-14]。

HBxAg表達與HCC發生、發展密切相關[15]。在抗HBxAg單抗（188Re-anti-HBx Mab）治療HBV相關HCC研究中，以持續表達HBxAg的肝癌Hep3B2.1-7細胞制備裸鼠人肝癌移植瘤模型，以188Re-4H9 Mab治療，發現肝癌組織188Re-4H9 Mab特異性聚集，瘤體明顯縮小，呈劑量依賴性[16]。病理學檢查見瘤內出現壞死、出血程度明顯高于對照組。因核素標記的抗HBx Mab的靶點是癌細胞或病毒感染細胞的表面抗原，而非體內自身抗原，與以往核素標記單抗相比，特異性更高、對正常細胞毒性更低。提示該單抗與HBx抗原特異結合，不僅可用于HCC治療，且可在HBV持續感染而非癌變階段發揮治療作用[17-18]。

2 炎癥介質NF-κB與肝癌

臨床證實HCC為炎癥相關性惡性腫瘤，核轉錄因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）活化在炎癥和癌變間充當橋梁角色并與多藥耐藥的發生相關[19]。肝細胞癌變過程中NF-κB異常表達，與其受體結合經信號轉導途徑誘導病變細胞凋亡，以建立細胞快速防御機制，發揮抗凋亡作用。活化NF-κB促腫瘤壞死因子(TNF)-α轉錄產生反饋調節，使NF-κB抗凋亡效應增強從而促進癌變，以蛋白酶體抑制劑阻斷NF-κB活化可逆轉癌細胞對TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)耐受性，增強TRAIL所誘導癌細胞凋亡[20]。肝癌HepG2、SMMC 7721細胞死亡受體-5 (DR5)表達水平明顯升高，正常肝細胞卻很少。抗DR5單抗干預TRAIL介導的NF-κB活化，可選擇性誘導癌細胞凋亡，抑制P38絲裂原活化蛋白激酶磷酸化和NF-κB活化，下調MMP-9和細胞間粘附分子1表達，進而抑制癌細胞增殖、侵襲和血管生成，改變肝癌細胞的生物學特性[21-16]。

NF-κB是炎癥相關多中心、多基因和多步驟肝癌的重要介質，從慢性肝炎到肝癌過程中癌組織NF-κB表達，顯著高于肝硬化或慢性肝炎的癌周組織（伴不典型增生），并伴肝免疫炎癥反應相關基因、肝炎病毒相關基因和原癌基因轉錄表達[22]。NF-κB為誘導DNA結合型轉錄因子，兩關鍵分子NF-κB1和NF-κBIα基因具有啟動子功能的單核苷酸多態性，為HBV C基因型HCC的獨立危險因素。肝癌中NF-κB 1-94ATTG2和NF-κBIA 3’非翻譯區GG等位基因頻率，顯著高于對照和慢性乙肝患者；NF-κBIA-826CT和NF-κBIA-881AG等位基因頻率顯著高于非HCC感染者，且這種關聯性在C型HBV感染致癌中顯著，提示C基因型HBV致癌能力高于B基因型，且與NF-κB遺傳易感性有關[23-24]。

以大鼠制備肝癌發生的動態模型觀察，在肝細胞變性、癌前病變和癌變的過程中，肝組織總RNA呈梯度進行性增加，DNA合成及核酸代謝旺盛。全基因組（鼠28 000個基因）表達譜分析，發現與對照組相比早期HCC有2 898個基因上調，其中1 179個基因上調幅度大于2倍，268個基因上調幅度大于8倍；晚期HCC有3 208個基因上調；晚期HCC與早期HCC相比2 416基因上調，涉及細胞周期相關基因、與信號轉導相關基因、腫瘤轉移相關基因、凋亡抑制基因、抑癌基因及黏附分子等，可見癌變過程復雜，決定了肝癌靶向治療極其艱難。然而干預NF-κB活化或中和TNF-α所介導的信號傳導可延緩肝癌發生，或者干預肝癌細胞中NF-κB的轉錄，可明顯抑制肝癌細胞增殖和生物學特性的改變[25-26]。

3 癌胚性甲胎蛋白(AFP)抗原與肝癌免疫治療

癌胚性AFP是胚胎期肝細胞合成的由609個氨基酸單鏈多肽組成的糖蛋白，3個結構域N端含19個氨基酸殘基的前導信號點[27-28]，可被主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex,MHC）I或II類分子識別，遞呈CD4+和CD8+T細胞，活化T細胞可識別免疫顯性抗原（Immuno dominant）和亞免疫顯性抗原（Sub-dominant）表位，表1。發揮免疫調節作用，其多肽疫苗作用和策略是誘導和激發機體抗AFP特異免疫反應[29-30]。

表1 AFP免疫和亞免疫顯性抗原表位的分子結構

免疫顯性及亞顯性表位均能被MHCⅠ類分子所識別，都有特異性誘導T淋巴細胞活化的能力，且人類T細胞庫在MHCⅠ類免疫反應中可識別AFP抗原表位。HLA-A24陽性HCC患者外周血單核細胞，發現5種HLA-A*2402限制性T細胞表位來源于AFP衍生肽，可誘導CTL產生γ干擾素（INF-γ），且可殺死AFP陽性肝癌細胞。以AFP衍生肽作為抗原表位殺傷肝癌細胞研究已進入臨床試驗。即使AFP衍生肽能有效地作為肝癌特異性靶點但問題很多，如DC功能、特異CTL、CD8+T細胞反應和AFP陰性HCC靶向治療等有待研究[31-32]。

4 癌胚性磷脂酰肌醇蛋白多糖-3 與肝癌免疫治療

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（Glypican-3，GPC-3）為胞膜表面糖蛋白，正常肝無表達，HCC組織過表達并位于胞質和胞膜，高于癌旁組織與HBV感染相關，遠癌未見表達[33-34]。構建位于HepG2胞膜的錨定蛋白(GPC3+α+EGFP)與淋巴細胞共培養，經Fas-Fas L通路抑制癌細胞增值，促進凋亡[35-36]。GPC-3過表達與基質金屬蛋白酶(MMP)-2、纖維母細胞生長因子(FGF)-2、FGF受體-1、FGF受體-2、硫酸酯酶-1（SULF-1)和SULF-2顯著相關，抑制GPC-3可下調MMP；GPC-3表達，胞核/胞質β-catenin顯著增高；與MMP及增殖信號結合，促進HCC進展。SULF-2增強細胞表面GPC-3和Wnt3a表達，穩定β-catenin激活T細胞轉錄因子，Wnt/β-catenin靶基因cyclinD1，SULF-2致癌作用，經上調GPC-3刺激Wnt/β-catenin通路，誘導癌細胞增殖；與高親和Hh競爭性抑制相應受體結合，調控增殖和分化等[37-38]。

癌胚性GPC-3除診斷與鑒別HCC外，極可能為HCC治療的新靶點，表2。抗GPC-3單抗(GC33)誘導GPC-3陽性肝癌細胞產生明顯抗體依賴的細胞介導的細胞毒(ADCC)作用，對肝癌Huh-7和HepG2細胞移植瘤具有明顯生長抑制作用。肝癌患者GPC-3高表達，其免疫原性在鼠模型和細胞培養物得以證明。因GPC-3特異性T細胞在肝癌患者血中表達較低，但在優化共刺激下體外擴增會增高。GPC-3對肝再生和肝細胞增殖起負調節作用[39-40]。以RNAi沉默GPC-3，可顯著抑制肝癌MHCC-97H細胞的增殖和侵襲，瘤體衰減。

表2 GPC-3作為肝癌免疫治療的分子靶點

GPC-3位于Wnt/β-catenin信號通路的上游，下調SULF2或干預其基因轉錄后，通過該通路可抑制HCC生長，其可作為治療新方案，具有開發應用前景[43-44]。抗GPC-3單抗(GC33)治療HCC，抑制HepG2和Huh7增殖，使HepG2細胞合成AFP下降。將GC33與化療藥物索拉非尼聯合能有效抑制腫瘤。以GPC-3轉染修飾樹突狀細胞(DCs)激活人T細胞并引發細胞介導免疫反應，對抗HepG2細胞增殖和轉移，GPC-3轉染DCs細胞對HepG2細胞產生高特異細胞毒性，用pEF-hGPC3質粒轉染DCs刺激效應細胞可有效溶解HepG2細胞，有望成為HCC新疫苗，建立缺GPI錨定區的突變GPC-3(sGPC3)載體，轉染HCC細胞，sGPC3通過Wnt信號顯著抑制癌細胞增殖，抑制HCC生長，是有價值的治療工具[41-45]。

5 展望

綜上所述，肝癌與病毒慢性感染，癌基因及癌相關基因激活及抑癌基因失活等相關，癌變機制復雜，有效治療仍是世界性難題[1,46]。手術治療仍是目前首選方法，療效的關鍵取決于早診診斷；晚期肝癌缺乏有效治療手段，免疫治療與手術、放化療、介入等綜合治療，可望改善療效，延長存活時間[47-48]。隨著基因組學、蛋白質組學飛速發展，分子病理學、分子藥理學及基因工程技術的不斷進步，分子剪接、基因沉默、干預轉錄和單抗技術可直接封閉癌細胞生長相關通路的信號分子或作為放射性核素、藥物和毒素等載體，進行基因置換、基因增補、基因矯正和免疫治療等分子靶向研究，將會有更多、特異性更強、副作用更小的方法研制成功并在肝癌靶向治療中發揮作用。

1.Bruix J,Reig M,Sherman M.Evidence-based diagnosis, staging,and treatment of patients with hepatocellular carci-noma[J].Gastroenterology,2016,150(4):835-853.

2.Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA cancer J Clin，2016，66(2):115-132.

3.Riviere L,Ducroux A,Buendia MA.The oncogenic role of hepatitis B virus[J].Recent Results Cancer Res，2014, 193(1):29-74.

4.Aerts M,Benteyn D,Van Vlierberghe H,et al.Current status and perspectives of immune-based therapies for hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol，2016，22(1):253-261.

5.Li S,Yang F,Ren X.Immunotherapy for hepatocellular carcinoma[J].Drug Discov Ther，2015，9(5):363-371.

6.Harrington M.Immune therapy for liver cancer[J].Lab Anim(NY)，2014，43(8):257.

7.Guo J,Friedman SL.The expression patterns and clinical significance of microRNAs in liver diseases and hepatocellular carcinoma[J].Curr Pharm Des，2013，19(7):1262-1272.

8.Negrini M,Gramantieri L,Sabbioni S,et al.microRNA involvement in hepatocellular carcinoma[J].Anticancer A-gents Med Chem，2011，11(6):500-521.

9.Ringelhan M,O'Connor T,Protzer U,et al.The direct and indirect roles of HBV in liver cancer:prospective markers for HCC screening and potential therapeutic targets[J].J Pathol，2015，235(2):355-367.

10.Zhu M,Lu Y,Li W,et al.Hepatitis B virus X protein driven alpha fetoprotein expression to promote malignant behaviors of normal liver cells and hepatoma cells[J].J Cancer，2016，7(8):935-946.

11.Moyo B,Nicholson SA,Arbuthnot PB.The role of long non-coding RNAs in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J].Virus Res，2016，212:103-113.

12.Chen LP,Zhao J,Du Y,et al.Antiviral treatment to prevent chronic hepatitis B or C-related hepatocellular carcinoma[J].World J Virol，2012，1(6):174-183.

13.Zhu R,Mok MT,Kang W,et al.Truncated HBx-dependent silencing of GAS2 promotes hepatocarcinogenesis through deregulation of cell cycle,senescence and p53-mediated apoptosis[J].J Pathol，2015，237(1):38-49.

14.Chen JY,Chen YJ,Yen CJ,et al.HBx sensitizes hepatocellular carcinoma cells to lapatinib by up-regulating ErbB3[J].Oncotarget，2016，7(1):473-489.

15.Wang Y,Zeng LI,Chen W.HBV X gene point mutations are associated with the risk of hepatocellular carcinoma:A systematic review and meta-analysis[J].Mol Clin Oncol，2016，4(6):1045-1051.

16.Kongkavitoon P,Tangkijvanich P,Hirankarn N,et al. Hepatitis B virus HBx activates Notch signaling via deltalike 4/Notch1 in hepatocellular carcinoma[J].PLoS One，2016，11(1):0146696.

17.Huang P,Zhuang B,Zhang H,et al.Hepatitis B virus X protein(HBx)is responsible for resistance to targeted therapies in hepatocellular carcinoma:ex vivo culture evidence [J].Clin Cancer Res，2015，21(19):4420-4430.

18.Liu H,Lou G,Li C,et al.HBx inhibits CYP2E1 gene expression via down-regulating HNF4 in human hepatoma cells[J].PLoS One，2014，9(9):107913.

19.Yao M,Gu X,Wang L,et al.Abnormal expression of circulating nuclear factor-κB in hepatocellular carcinoma and reversal of multidrug resistance through intervening its gene transcription[J].Zhonghua Yixue Zazhi，2016，96(10): 761-766.

20.Li W,Xiao J,Zhou X,et al.STK4 regulates TLR pathways and protects against chronic inflammation-related hepatocellular carcinoma[J].J Clin Invest，2015，125(11): 4239-4254.

21.Wu W,Yao D,Wang Y,et al.Suppression of human hepatoma(HepG2)cell growth by nuclear factor-kappaB/ p65 specific siRNA[J].Tumour Biol，2010，31(6):605-611.

22.Cho HJ,Kim SS,Wang HJ,et al.Detection of novel genomic markers for predicting prognosis in hepatocellular carcinoma patients by integrative analysis of copy number aberrations and gene expression profiles:results from a long-term follow-up[J].DNA Cell Biol，2016，35(2): 71-80.

23.Zhang Q,Ji XW,Hou XM,et al.Effect of functional nuclear factor-kappa B genetic polymorphisms on hepatitis B virus persistence and their interactions with viral mutations on the risk of hepatocellular carcinoma[J].Ann Oncol，2014，25(12):2413-2419.

24.Amin A,Hamza AA,Daoud S,et al.Saffron-based crocin prevents early lesions of liver cancer:in vivo,in vitro and network analyses[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov，2016，11(1):121-133.

25.Dong ZZ,Yao DF,Wu W,et al.Delayed hepatocarcinogenesis through anti-angiogenic intervention in the nuclear factor-kappa B activation pathway in rats[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2010，9(2):169-174.

26.Wu W,Yao DF,Qiu LW,et al.Characteristics of hepatic nuclear-transcription factor-kappa B expression and quantitative analysis in rat hepatocarcinogenesis[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2009，8(5):504-509.

27.Li Z,Wang XP,Lin HP,et al.Anti-tumor immunity elicited by cross-linking vaccine heat shock protein 72 and alpha-fetoprotein epitope peptide[J].Neoplasma，2015，62(5):713-721.

28.Wang XP,Wang QX,Lin HP,et al.Glycoprotein 96 and α-fetoprotein cross-linking complexes elicited specific antitumor immunity[J].Cancer Biother Radiopharm，2013，28(5):406-614.

29.Yang JY,Li X,Gao L,et al.Co-transfection of dendritic cells with AFP and IL-2 genes enhances the induction of tumor antigen-specific antitumor immunity[J].Exp Ther Med，2012，4(4):655-660.

30.He Y,Hong Y,Mizejewski GJ.Engineering α-fetoprotein-based gene vaccines to prevent and treat hepatocellular carcinoma:review and future prospects[J].Immunotherapy，2014，6(6):725-736.

31.Zhou J,Ma P,Li J,et al.Comparative analysis of cytotoxic T lymphocyte response induced by dendritic cells pulsed with recombinant adeno-associated virus carrying α-fetoprotein gene or cancer cell lysate[J].Mol Med Rep，2015，11(4):3174-3180.

32.Schmidt N,Flecken T,Thimme R.Tumor-associated antigen specific CD8+T cells in hepatocellular carcinomaa promising target for immunotherapy[J].Oncoimmunology，2014，3(9):954919.

33.Wang L,Yao M,Pan LH,et al.Glypican-3 is a biomarker and a therapeutic target of hepato-cellular carcinoma [J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2015，4(4):361-266.

34.Haruyama Y,Kataoka H.Glypican-3 is a prognostic factor and an immuno-therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol，2016，22(1):275-283.

35.Gao W,Kim H,Ho M.Human monoclonal antibody targeting the heparan sulfate chains of glypican-3 inhibits HGF-mediated migration and motility of hepatocellular carcinoma cells[J].PLoS One,2015,10(9):0137664.

36.Wang Y,Wang Y,Mu H,et al.Enhanced specific antitumor immunity of dendritic cells transduced with the glypican 3 gene and cocultured with cytokine-induced killer cells against hepatocellular carcinoma cells[J].Mol Med Rep,2015,11(5):3361-3367.

37.Hanaoka H,Nagaya T,Sato K,et al.Glypican-3 targeted human heavy chain antibody as a drug carrier for hepatocellular carcinoma therapy[J].Mol Pharm,2015,12(6): 2151-2157.

38.Dargel C,Bassani-Sternberg M,Hasreiter J,et al.T cells engineered to express a T-cell receptor specific for glypican-3 to recognize and kill hepatoma cells in vitro and in Mice[J].Gastroenterology,2015,149(4):1042-1052.

39.Dong Z,Yao M,Wang L,et al.Down-regulating glypican-3 expression:molecular-targeted therapy for hepatocellular carcinoma[J].Mini Rev Med Chem,2014,14(14): 1183-1193.

40.Gao H,Li K,Tu H,et al.Development of T cells redirected to glypican-3 for the treatment of hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2014,20(24):6418-6428.

41.Zaghloul RA,El-Shishtawy MM,El Galil KH,et al.E-valuation of antiglypican-3 therapy as a promising target for amelioration of hepatic tissue damage in hepatocellular carcinoma[J].Eur J Pharmacol,2015,746:353-362.

42.Yao M,Wang L,Shi Y,et al.Intervention of glypican-3 genetic transcription on anti-proliferative effect of hepatoma cells with high metastatic potentiality[J].Zhonghua Yixue Zazhi,2014,94(32):2544-2548.

43.Yu D,Dong Z,Yao M,et al.Targeted glypican-3 gene transcription inhibited the proliferation of human hepatoma cells by specific short hairpin RNA[J].Tumour Biol,2013, 34(2):661-668.

44.Yao M,Wang L,Dong Z,et al.Glypican-3 as an emerging molecular target for hepatocellular carcinoma gene therapy[J].Tumour Biol,2014,35(6):5857-5868.

45.Wang Y,Li H,Liang Q,et al.Combinatorial immunotherapy of sorafenib and blockade of programmed death-ligand 1 induces effective natural killer cell responses against hepato-cellular carcinoma[J].Tumour Biol, 2015,36(3):1561-1566.

46.Tagliamonte M,Petrizzo A,Tornesello ML,et al.Combinatorial immunotherapy strategies for hepatocellular carcinoma[J].Curr Opin Immunol,2016,39:103-113.

47.Wagenaar TR,Zabludoff S,Ahn SM,et al.Anti-miR-21 suppresses hepatocellular carcinoma growth via broad transcriptional network deregulation[J].Mol Cancer Res, 2015,13(6):1009-1021.

48.Harding JJ,El Dika I,Abou-Alfa GK.Immunotherapy in hepatocellular carcinoma:primed to make a difference?[J] Cancer,2016,122(3):367-377.

（2016-7-30收稿）

R392.1

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.05.001

*國家國際科技合作專項(2013DFA32150)，江蘇省“六大人才高峰”項目(2014-YY-028)

姚登福，男，教授，博士生導師。E-mail:yaodf@ahnmc.com