一種病證結合痰濁阻竅證老年期癡呆大鼠模型的建立*

陳燕清，張俊龍，郭 蕾，秦亞莉，韓 誠

(山西中醫學院基礎醫學院，太原 030024)

一種病證結合痰濁阻竅證老年期癡呆大鼠模型的建立*

陳燕清，張俊龍△，郭 蕾，秦亞莉，韓 誠

(山西中醫學院基礎醫學院，太原 030024)

目的:建立一種病證結合的痰濁阻竅證老年期癡呆大鼠模型。方法:61只大鼠隨機分為A空白對照組、B老年性癡呆組、C血管性癡呆組、D痰濁阻竅證組、E病證結合(AD+VD+痰濁阻竅證)組，從Morris水迷宮、血脂、海馬神經元超微結構等不同方面，對痰濁阻竅證老年期癡呆大鼠模型的建立進行初步探索。結果:造模成功后，Morris水迷宮實驗顯示B、C、E組與A組間逃避潛伏期及目標象限停留時間、原平臺區穿越次數數據，差異有統計學意義。血脂化驗顯示，D組及E組的TC、LDL-C升高為其余各組的2倍以上。透射電鏡下觀察大鼠海馬CA1區超微結構，可見E組的神經元細胞超微結構受損最為嚴重，B組次之，再次為C組與D組。結論:該模型可作為痰濁阻竅證老年期癡呆模型使用，用于老年期癡呆的實驗研究。

病證結合;痰濁阻竅證;老年期癡呆

老年期癡呆［1］是指老年人(＞60歲)出現持續時間較長的智力損害，表現為記憶、計算、思維、定向力、情感障礙及人格改變，并出現社會活動能力和自身活動能力的減退，其主要臨床類型包括老年性癡呆(AD)和血管性癡呆(VD)［2］。國內研究表明［3］，60歲以上的老年人中按癡呆的患病率為0.75% ～4.69%。中醫藥治療老年期癡呆具有肯定的療效，但目前對于動物模型的藥效學和作用機制的探討，多停留于西醫疾病水平，很少結合中醫的證候因素進行研究，病證結合的老年期癡呆動物模型較少。本研究通過集VD、AD及痰濁阻竅證于一體的大鼠模型，為建立一種新的病證結合老年期癡呆大鼠模型提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

健康SPF級SD雄性大鼠61只，體質量(300± 20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號SCXK(京)2012-0001)。大鼠在相同條件下喂養，室溫(22±2)℃，保持自然光照，自由飲水、攝食。適應性喂養1周后，應用Rand函數將大鼠隨機分為A組(空白對照組)9只，B組(老年性癡呆組)13只，C組(血管性癡呆組)13只，D組(痰濁阻竅證組)13只，E組(病證結合AD+VD+痰濁阻竅證)13只。

1.2 藥品與儀器

D-半乳糖(Amresco公司，批號20120120);水合氯醛(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20100331);戊二醛(成都市新都區木蘭鎮工業開發區，批號0120213);DigBehv-MG(通用型)Morris水迷宮視頻分析系統(上海吉量軟件科技有限公司); JEM-1011透射電鏡(日本電子公司);高脂飼料購自北京華阜康生物科技有限公司，高脂飼料配方為10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.5%丙基硫氧嘧啶，78.5%基礎飼料。

2 方法

2.1 造模方法

各組大鼠同時開始處理。A組每日以生理鹽水1 ml腹腔注射，連續6周;B組每日D-半乳糖50 mg/kg腹腔注射，連續6周;C組先結扎一側頸總動脈，1周后結扎另外一側。A、B、C組均喂飼普通飼料。D組采用高脂飼料喂養，連續6周;E組同C組方式結扎雙側頸總動脈，每日D-半乳糖50 mg/kg腹腔注射，并采用高脂飼料喂養，連續6周。

2.2 行為學測試

6周造模結束后，采用Morris水迷宮測試大鼠的學習記憶能力。在目標象限放置沒入水下2 cm的平臺，采用視頻攝像跟蹤技術，同步記錄大鼠運動軌跡。前5 d進行定位航行實驗檢測大鼠的學習能力，選取目標象限及對側象限將大鼠面向池壁放入水中，系統記錄大鼠尋找并爬上平臺時所需時間(即逃避潛伏期)，每次訓練時間為120 s。如果大鼠在規定時間內未找到平臺，須將其引至平臺并停留20 s。第6天進行空間搜索實驗，撤除平臺，在目標象限的對側象限將大鼠面向池壁放入水中，系統記錄大鼠在60 s內目標象限停留時間及原平臺區穿越次數，測試大鼠的記憶保持能力。

2.3 電鏡樣品的制備

6 d水迷宮測試結束后，禁食不禁水12 h，5%水合氯醛(7 ml/kg)腹腔注射麻醉，開腹、腹主動脈采血2 ml用于檢測血脂。開胸暴露心臟，灌注針由心尖部插入升主動脈，同時剪開右心耳，用預冷到4℃的生理鹽水快速灌注200 ml，至流出液清亮，然后換用預先冷藏的2.5%戊二醛PBS液灌注200 ml，充分固定，冰盤上迅速取腦，剝離右側海馬，在海馬CA1區切取大小為1 mm3的組織塊，放入預冷的pH 7.0，2.5%的戊二醛固定液3 h，緩沖液中冷藏待檢。電鏡室采用1%鋨酸固定，梯度丙酮逐級脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片厚度60～80 nm，醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察大鼠海馬CA1區神經細胞內超微結構，并選取典型部位攝片。

2.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差(±s)表示。水迷宮的定位航行實驗數據采用重復測量兩因素多水平方差分析，其余數據采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 Morris水迷宮檢測結果

3.1.1 定位航行實驗結果 表1顯示，5組大鼠隨著訓練時間的推移，尋找平臺的時間都在縮短。但各組大鼠的學習記憶能力不同，從第2天開始，B、C、E組與A組比較，逃避潛伏期明顯延長，差異有統計學意義(P＜0.05)。D組與A組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 定位航行實驗各組大鼠逃避潛伏期的變化(±s)

表1 定位航行實驗各組大鼠逃避潛伏期的變化(±s)

注:與A組比較:▲P＜0.05

組 別 鼠數逃避潛伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天A組 9 110.6±12.2 62.2± 3.5 29.7± 7.9 10.0±2.0 6.9±2.3 B組 11 115.2±11.3 79.6± 4.5▲ 43.5± 8.3▲ 32.3±9.3▲ 27.4±6.8▲C組 10 107.3± 8.2 81.9± 9.3▲ 42.7±11.5▲ 33.3±4.6▲ 23.7±7.3▲D組 9 106.8± 3.8 63.3±13.5 31.0± 3.2 12.0±3.5 8.5±5.8 E組 9 113.2± 9.3 82.1± 5.1▲ 65.1± 8.9▲ 39.6±6.8▲ 29.2±7.6▲

3.1.2 空間搜索實驗結果 表2顯示，B、C、E組與A組比較，目標象限停留時間、原平臺區穿越次數差異有統計學意義(P＜0．01)。D組與A組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠目標象限停留時間、原平臺區穿越次數(±s)

表2 各組大鼠目標象限停留時間、原平臺區穿越次數(±s)

注:與A組比較:▲▲P＜0.01

組別 鼠數 目標象限停留時間(s)原平臺區穿越次數A組9 49.18±3.23 7.39±1.36 B組 11 28.69±6.15▲▲ 3.23±1.31▲▲C組 10 26.06±8.19▲▲ 3.56±1.73▲▲D組 9 47.96±3.68 6.96±1.99 E組 9 25.05±5.13▲▲ 3.54±1.65▲▲

3.2 血脂檢測結果

表3顯示，各組大鼠的TC與LDL-C水平比較，D組與E組比A組明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠血脂檢驗結果(±s)

表3 各組大鼠血脂檢驗結果(±s)

注:與A組比較:▲P＜0.05。

組別 鼠數TC TG HDL-C LDL-C A組9 1.27±0.28 0.31±0.11 0.88±0.06 0.25±0.01 B組 11 1.21±0.31 0.35±0.06 0.79±0.12 0.23±0.07 C組 10 1.19±0.15 0.42±0.13 0.82±0.11 0.31±0.08 D組 9 3.39±0.49▲ 0.47±0.02 0.79±0.07 1.61±0.12▲E組 9 3.28±0.36▲ 0.43±0.02 0.77±0.14 1.82±0.21▲

3.3 電鏡觀察海馬CA1區神經元細胞超微結構結果

圖1顯示，各組大鼠海馬CA1區神經元細胞內超微結構如線粒體、軸突、細胞核、溶酶體等變化。

圖1 各組海馬CA1區神經元細胞超微結構

電鏡下可見，A組的細胞器結構正常，線粒體結構清晰;細胞核的核型規整，核膜完好;神經突觸結構完整，突觸小泡均勻。B組細胞內線粒體空泡變性，線粒體嵴脫落，排列紊亂;細胞核核型不規整，表面凹凸不平，核膜發生斷裂;突觸小泡減少。C組細胞線粒體結構不清，嵴脫落斷裂，高爾基體腫脹，并有自噬現象的次級溶酶體，吞噬物主要為破碎的線粒體;細胞核核型不規整，核膜有斷裂現象，突觸小泡減少。D組細胞線粒體腫脹變形，嵴排列紊亂;細胞核無明顯變化，神經突觸相對正常。電鏡下觀察，本組標本在各造模組中損害最輕。E組海馬CA1區神經元細胞線粒體腫脹、膜破裂，出現多量畸形線粒體。次級溶酶體有明顯的自噬現象，吞噬物主要為破碎的線粒體。細胞核變形，染色體邊集，核膜斷裂。突觸連接間斷，突觸小泡明顯減少。電鏡下觀察，本組標本在各造模組中損害最為嚴重。

4 討論

從臨床可知，VD與AD的癥狀、病理、神經生物化學等諸多特點經常交叉重疊，難以截然分開［4］，且常見2種癡呆并存［5］。故本次實驗設計了結扎雙側頸總動脈造成VD模型，并同時給予D-半乳糖腹腔注射造成AD的復合疾病模型。鑒于之前同時結扎雙側頸總動脈，大鼠腦部短時間內缺血損害嚴重，腦部供血不能迅速代償，死亡率高。本次實驗參照文獻［6］間隔1周結扎兩側的頸總動脈，大鼠存活率較高。采用經典的考察大鼠學習記憶能力的Morris水迷宮進行驗證，老年期癡呆疾病模型造模成功。

中醫認為，高脂血癥乃血中之痰濁，屬于“無形之痰”范疇［7］。研究發現［8］，痰濁證患者血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量均明顯高于非痰濁證組和正常人組。高脂血癥的脂質水平和中醫辨證分型有一定的相關性［9］，即高血脂為血中痰濁的客觀指標或生化物質基礎［10］。現代醫學認為，外源性的脂質攝入是血脂升高的重要原因。本次實驗采用高脂飼料喂養42 d的方式造成大鼠高脂血癥。血脂結果顯示，喂飼高脂飼料的痰濁阻竅證組、病證結合組的TC、LDL-C明顯升高，但TG、HDL-C無明顯變化，與文獻報道［11］的高脂飼料可以造成大鼠的高膽固醇血癥一致，高膽固醇血癥可以看作是中醫的痰濁證。透射電鏡結果顯示，造模各組海馬CA1區的神經元細胞都有程度不同的損害，其中尤以造模干預最多的病證結合組最為嚴重。但是只單純喂飼高脂飼料的痰濁阻竅證的CA1區神經元細胞也有損害，這些損害積聚到一定程度，也可能成為癡呆癥狀產生的物質基礎，故高脂血癥可以看作是痰濁阻竅證。

病證結合的中醫動物模型是指在制作模型時，將西醫的疾病與中醫證候同時加以考慮，不僅能夠體現疾病的生理病理變化，而且具備中醫證候特征，此類模型在用于中醫藥的研究時具有獨特的優勢［12］。本次實驗在老年期癡呆動物模型的基礎上疊加了中醫的痰濁阻竅證，造成病證結合的動物模型，在癡呆疾病中引進中醫痰濁證的病因病機，為建立一種病證結合老年期癡呆動物模型進行了有益的探索。

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Establishment of the Combined Disease and Syndrome Model of Phlegm Blockage in Senile Dementia Rats

CHEN Yan-qing，ZHANG Jun-long△，GUO Lei，QIN Ya-li，HAN Cheng
(Shanxi University of Traditional Chinese medicine，Taiyuan 030024，China)

The syndrome of phlegm obstructing orifices of senile dementia rat model was established by a combination of disease and syndrome．Methods:61 rats were randomly divided into A blank control group，B AD group，C VD group，D phlegm blocking orifices group，E combination of disease and syndrome(AD+VD+syndrome of phlegm obstructing orifices)group，from the behavior of rats，biochemical，morphological aspects preliminary exploration of establishing model，the syndrome of phlegm obstructing orifices of senile dementia rats．Results:After the success of modeling，Morris water maze test showed that B，C，E group and A group had significant difference．Blood tests:D group and E group TC，LDL-C increased above 2 times+the other groups．Observation on ultrastructure of hippocampus CA1 area of rats under transmission electron microscope，neuronal cell ultrastructure was observed in E group the damage was most severe，followed by the B group，C group and D group again．Conclusion:The model may be used as phlegm blocking orifices of senile dementia model，used for experimental study of senile dementia．

Combination of disease and syndrome;Syndrome of phlegm obstructing orifices; Senile dementia

R-332

B

1006-3250(2016)02-0174-03

2015-06-24

國家自然科學基金資助項目(81173165)-老年期癡呆典型證候病證結合判別模式研究;國家自然科學基金資助項目(81202623)-老年性癡呆腎陽虛證與痰濁阻竅證同病異證及方證相應的生物學機制研究;山西省自然科學基金資助項目(2013011051-3)-老年性癡呆模型大鼠同病異證的機制研究

陳燕清(1973-)，女，山西太谷人，副教授，醫學博士，從事藏象理論研究。

△通訊作者:張俊龍(1963-)，男，山西吉縣人，教授，醫學博士，從事中醫基礎理論，E-mail:jlzhang63@163．com。