生殖激素調節顆粒細胞凋亡的機制研究進展

李彩萍

（廣西水產畜牧學校，廣西南寧 530021）

生殖激素調節顆粒細胞凋亡的機制研究進展

李彩萍

（廣西水產畜牧學校，廣西南寧 530021）

研究表明顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的重要原因，調控顆粒細胞凋亡的因素是多種的，而生殖激素如生長激素、抑制素、活化素、卵泡抑素等間接地和直接地對卵巢卵泡顆粒細胞凋亡發揮重要的綜合調控作用，這些激素通過多種信號轉導途徑調節顆粒細胞的凋亡，成為卵泡的存活因子和死亡因子。這些途徑相互交聯，構成信號網絡，與卵巢的旁分泌、內分泌、自分泌途徑一起參與卵泡閉鎖和顆粒細胞的凋亡。

生殖激素；顆粒細胞凋亡；機制研究

卵泡在發育到排卵前所發生的退化最終被清除的生理現象，人們稱之為卵泡閉鎖。在大多數哺乳動物及禽類中，70～99.9%的卵泡在排卵前發生閉鎖。現已證實，卵泡閉鎖主要是通過細胞凋亡來完成的，包括卵母細胞凋亡和顆粒細胞凋亡。卵母細胞的凋亡引發的卵泡閉鎖主要發生在原始卵泡，初級卵泡及腔前卵泡，而顆粒細胞的凋亡主要發生在有腔卵泡和次級未排卵的卵泡。但目前比較一致的看法認為顆粒細胞的凋亡觸發了卵泡閉鎖，顆粒細胞的凋亡已經在雞、豬、水牛、兔等多種動物上得到證實。

與細胞分裂分化的過程一樣，細胞凋亡也是細胞在內外的復雜分子環境條件刺激之下所發生的一種基因調控反應。在卵巢卵泡顆粒細胞內參與細胞凋亡的因子是多樣的，而激素被認為是調節顆粒細胞凋亡最主要的因子，它們通過旁分泌、內分泌及自分泌途徑等多種信號途徑參與顆粒細胞凋亡，從而調控卵泡閉鎖。

1 促性腺激素參與的顆粒細胞凋亡的信號調控

促性腺激素與哺乳動物卵巢的卵泡募集、選擇、分化及維持優勢卵泡生長密切相關。當一卵泡波中出現大卵泡時（大約4mm）時FSH峰出現。卵泡募集和循環中FSH水平的輕微升高時間性聯系，卵泡的選擇與循環中FSH 水平的降低有關，當FSH峰降低到最低點時，未來的優勢卵泡和最大的次級卵泡以相同的速率生長，一直到某一點時兩者的生長速度明顯不同，這一點被稱為分化。然后LH濃度在分化開始后1d或2d急劇升高，刺激卵泡液中雌二醇的升高，從而維持優勢卵泡的生長直至排卵。因此，FSH和LH被認為是卵泡的存活因子。大量的體內外研究表明，FSH能夠單獨或者與其他因子協同作用抑制顆粒細胞自發性凋亡。

信號轉導研究表明，促性腺激素通過PKA/cAMP信號轉導抑制顆粒細胞凋亡，而在此途徑中首先發揮作用的是血管活性腸肽和垂體腺苷酸環化酶活性多肽（PACAP），它們能夠刺激培養顆粒細胞的類固醇分泌以及cAMP的積累，cAMP的類似物dibutylrylcAMP也能模擬這一作用，并且8-bromo-cAMP也能促進顆粒細胞的存活。然而，PKA抑制劑H-89能快速地誘導培養的雞排卵前卵泡顆粒細胞的凋亡而阻止促性腺激素的存活效應。此外，Tilly等人［1］提出促性腺激素促進細胞存活可能是通過激活PKA途徑抑制促凋亡因子Bax，Apaf-1及caspase-3的表達，上調Bcl-2和BclxLONG的表達。與母雞優勢化前卵泡的顆粒細胞比較發現，排卵前的卵泡內顆粒細胞的bcl-2 mRNA水平和Bcl-xLONG蛋白明顯地增高。認為抑凋亡蛋白在顆粒細胞內水平過高，可有效地結合及中和胞漿內促凋亡蛋白Apaf-1，Bad及Bax，從而防止卵泡閉鎖。

也有證據表明促性腺激素，特別是FSH，能激活PKA途徑外的多種途徑，包括蛋白激酶B（PKB），蛋白激酶C（PKC），血清及糖皮質激素誘導的激酶途徑（SgK），p42-p44細胞外信號調節激酶（ERK）以及促有絲分裂蛋白激酶信號途徑（MAPK）。FSH是經過轉錄因子，NFκB激活PKC信號轉導。而PKB蛋白家族是通過3-磷酰肌醇-依賴性激酶1磷酸化而激活的，促性腺激素激活PKB途徑是不依賴PKA途徑的，因此PKA抑制劑H-89不能抑制FSH誘導的PKB磷酸化。有證據表明SgK能調節顆粒細胞增生及在卵泡發育和黃體形成期間的分化［2］。FSH和LH上調顆粒細胞內SgK的表達，通過PI-3激酶-PKD 1 酶級聯反應被激活，活化的SgK蛋白轉移到核內，在細胞核調節轉錄因子的活性，包括Forkhead蛋白家族成員。經性未成熟大鼠的卵泡顆粒細胞研究證實，FSH可以誘導P38 MAPK磷酸化，并被PKA抑致劑H89抑制，而cAMP的類似物卻可以模擬這種磷酸化現象，說明FSH誘導生成的cAMP及激活的PKA是激活顆粒細胞P38MAPK途徑的必要條件。

2 甾體類激素參與的顆粒細胞凋亡信號調控

2.1 雌激素和雄激素

雌激素具有促進卵泡生長，雄激素具有促進卵泡閉鎖及顆粒細胞凋亡的作用，二者之間有頡頏現象。據此，卵泡液內雄激素與雌激素的比值作為卵泡閉鎖的生化指標之一，比值升高表明正在發生閉鎖。

依據經典的受體學說，雌激素是通過與其胞質受體結合后調節蛋白表達而發揮其生理作用。但近些年研究表明，17β-E2能通過一種非基因性效應來調節胞內第二信使分子如Ca2+的變化，發揮其生理作用。也有研究指出卵巢卵泡內雌激素功能在于它作為活性氧清除劑，抑制卵泡顆粒凋亡。吳際等［3］分別用1μg/ml的雌激素和雄激素刺激體外培養的人卵巢顆粒細胞，用Northern 雜交技術檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達，發現與對照組比較，雌激素、雌激素加雄激素作用時bcl-2基因mRNA表達分別增加45%和20%左右，而雄激素作用時則下降35%左右，結果提示雌激素對顆粒細胞的作用機理可能與上調凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的表達有關，雄激素則可能與下調Bcl-2基因表達有關。

2.2 孕酮

卵巢顆粒細胞有孕酮的特異受體。P4可以抑制顆粒細胞凋亡，孕酮頡頏劑，RU486，能刺激卵泡閉鎖和促進顆粒細胞凋亡。孕酮抑制顆粒細胞凋亡是通過結合其核內受體PR，隨后調節基因的轉錄和細胞內的應答。有研究指出，大鼠卵泡顆粒細胞分為大小兩類，只有小顆粒細胞內存在孕酮受體，并當孕酮與小顆粒細胞內的孕酮受體結合后，刺激合成和分泌bFGF，而分泌的bFGF再與大、小顆粒細胞膜上的bFGF受體結合，抑制顆粒細胞凋亡，從而同時維持和保護大、小顆粒細胞的生存能力。盡管如此，孕酮的抗凋亡效應并不都是通過PR來實施的。泌乳小鼠的乳腺上皮細胞并不表達PR，但孕酮仍能維持其細胞活性。皮質脂酮通過乳腺上皮細胞表達的腎上腺皮質激素受體（GR）可阻斷細胞凋亡，因此孕酮可能結合及激活GR抗凋亡。

有研究指出核PR局部定位在胞漿膜上充當著孕酮膜受體［4］。然而從小鼠自然永生的顆粒細胞系抽提的RNA中卻不能檢測到PR mRNA，直到出現促性腺激素峰值后顆粒細胞才表達PR mRNA。這些結果說明PR不是孕酮在原代顆粒細胞或SIGCs的功能性膜受體。盡管對于孕酮的顆粒細胞功能性膜受體還未鑒定，但發現在原代顆粒細胞和SIGCs表達一種60kDa的蛋白，能結合孕酮。在配體斑點實驗中使用該蛋白抗體發現，該蛋白定位在胞漿膜上與孕酮結合，孕酮通過該蛋白傳導信號，可能非基因組的膜啟動機制介導孕酮這一作用。然而，對于這一機制卻了解得非常少，最近有研究表明孕酮通過維持基底水平的胞內游離 ［Ca2+］（［Ca2+］i）調控顆粒細胞凋亡［5］。同時，在孕酮影響［Ca2+］i及顆粒細胞活性方面，蛋白激酶G（PKG）是一個關鍵的調節點，藥理動力學實驗數據分析表明PKG參與孕酮的抗凋亡作用［6］。

3 促性腺激素釋放激素（GnRH）參與的顆粒細胞凋亡信號調控

有大量的證據表明促性腺激素釋放激素在體內外能促進顆粒細胞的凋亡，并具有時間、劑量的依賴性，并且促性腺激素釋放激素受體阻斷劑可完全阻斷這種凋亡現象。信號轉導機理研究提出，促性腺激素釋放激素與受體結合，增加細胞內Ca2+水平及逆轉磷酸化，可能PKC途徑轉導促性腺激素釋放激素的促進細胞凋亡的作用。Park等人用促性腺激素釋放激素類似物作用于體外培養的人黃體顆粒細胞，發現促性腺激素釋放激素受體急劇表達，細胞內Ca2+增多，caspase-3，-8，-9活性增強。結果說明促性腺激素釋放激素受體結合，通過細胞內第二信使激活caspase級聯，引起顆粒細胞凋亡。

4 生長激素（GH）參與的顆粒細胞凋亡調控

生長激素，直接或經由IGF-1，抑制排卵前卵泡閉鎖，增強細胞存活能力。當GH加入體外培養的牛卵泡顆粒細胞，能強烈地刺激顆粒細胞產生IGF、IGFBP-3和oxytocin，并明顯降低顆粒細胞凋亡率。在顆粒細胞的培養液中加入低濃度的GH（1-100ng/ mL），可刺激E2釋放，而高濃度的GH（10 mg/mL）抑制E2釋放。PKA抑制劑，KT5720和Rp-cAMP，可完全或部分地阻礙GH刺激顆粒細胞釋放IGF-1、IGFBP-3、oxytocin、P、E2，從而影響顆粒細胞的凋亡。因而可見，GH和cAMP/PKA在顆粒細胞內連鎖控制著這些因子分泌及凋亡發生，說明GH的效應可能是通過cAMP/PKA系統轉導的。

5 抑制素、活化素、卵泡抑素 參與的顆粒細胞凋亡信號調控

近年來，發現了來自卵巢的抑制素-激活素-卵泡抑素軸，它是調控FSH和LH分泌的新家族。抑制素和活化素是由α、βA、βB三種亞單位在二硫鍵聯接下的不同組合形成的作用相反的兩個二聚體。目前越來越多的報道指出，顆粒細胞所產生的抑制素和激活素對控制卵泡的發育起重要地調節作用，前者被認為是卵泡生存因子，而后者被認為是卵泡閉鎖因子。

5.1 抑制素

目前研究抑制素調節顆粒細胞凋亡還未見報道，多認為抑制素參與卵母細胞凋亡以調節卵泡閉鎖。在卵泡發育過程中，抑制素通過刺激雄激素產生而增加雌激素的合成，使其分化為優勢卵泡，對鄰近卵泡起到抑制作用，并引起這些卵泡的閉鎖。抑制素有大分子形式（＞160 kDa）和小分子形式（34，58，77 kDa），大分子形式抑制素在卵泡峰及FSH峰33h內急劇表達，并在優勢卵泡內維持24h，同時促進雌激素的合成及降低卵泡素的濃度，卵泡優勢化后，在次級卵泡和小卵泡內小分子抑制素及卵泡素增多。因此，抑制素與雌二醇、卵泡素一起在卵泡的分化、優勢選擇及卵泡閉鎖發揮重要作用，抑制素是否通過顆粒細胞的凋亡參與卵泡的閉鎖還有待證實。

5.2 活化素和卵泡抑素

活化素是抑制素β亞基同型二聚體，競爭性結合活化素受體Ⅱ以抑制抑制素在垂體及卵巢內的作用。顆粒細胞分泌的活化素能增加FSH受體的表達和抑制素的合成，并且促進早期卵泡發育中顆粒細胞的增生和激素合成，而卵泡抑素調節活化素與受體的結合以中和活化素在垂體和卵巢的作用。活化素通過增加IGFBP-4的水平促進嚙齒動物顆粒細胞的凋亡，這一作用不受LH的拮抗，而受卵泡抑素抑制；而活化素卻能抑制早期有腔卵泡的細胞凋亡，并且具有劑量的依賴性，這一作用也能被卵泡抑素卵泡抑素抑制。因此，活化素參與的細胞凋亡可能與卵泡發育的階段有關，并且受到卵泡抑素的調節。

6 結語

卵巢卵泡顆粒細胞凋亡是處在一個極其復雜的內環境控制下完成的，并具有高度的協調性。它不僅有下丘腦-垂體-卵巢軸調節作用，也有卵巢本身的旁分泌和自分泌因子的調控機制。但是生殖激素，如前所述，存在著很廣泛的調節機制，不僅遠距離地、間接地控制卵巢功能，而且在卵巢內（主要在顆粒細胞內）也發揮著十分顯著的直接的（或相反的）調節作用。有大量的證據表明在顆粒細胞表明存在著多種激素的受體，這些激素與受體結合刺激多種途徑以調節顆粒細胞的活動，啟動細胞內存活基因或死亡基因的轉錄。此外，激素調節機制也與卵泡發育有關，這可能與不同階段的卵泡內外環境有關。盡管如此，抑制素、活化素和卵泡抑素對顆粒細胞凋亡的影響機制還不是很清楚，它們通過何種途徑調控細胞凋亡及卵泡閉鎖的研究不是很透徹，還需要進一步的探討。此外，這些途徑構成一個網絡，它們之間的交聯對話仍有待我們深入探討。

［1］ Hsu，S.Y.，Hsueh，A.J. Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis：an ovarian paradigm［J］.Physiol.Rev，2000，（80）：593-614.

［2］ Gonzalez-Robayna，I.J.，Falender，A.E.，Ochsner，S.，et al. Follicle-stimulating hormone（FSH）stimulates phosphorylation and activation of PKB（PKB/Akt）and serum and glucocorticoid-induced kinase（Sgk）：evidence for A kinase-independent signaling by FSH in granulosa cells［J］.Mol.Endocrine.2000，（14）：1283-1300.

［3］ 吳際，張麗珠，李潭，等.性激素對人卵巢顆粒細胞凋亡的作用［J］.中華婦產科雜志，1998，3（33）：157-159.

［4］ V. Boonyaratanakornkit，M.P，Scott. V. Ribon，et al. Progesterone receptor contains a proline-rich motif that directly interacts with SH3 domains and activates c-Src family tyrosine kinases［J］. Mol. Cell，2001，8（2）：269-280.

［5］ J.J Peluso，G. Fernandez. A. Pappalardo，et al. Characterization of a putative memebrane receptor for progesterone in rat granulosa cells［J］. Biol. Reprod，2001，65（1）：94-101.

［6］ J.J. Peluso.Progesterone as a regulator of granulose cell viability［J］. Journal of Steroid Biochemistry&Molecular Biology，2003，（85）：167-173.

李彩萍（1980—），女，廣西南寧人，碩士研究生，主要從事畜牧獸醫中職教育工作，講師。