如何發揮獸醫實驗室檢測的最大效能

胡志剛 楊保華 （新疆生產建設兵團第六師新湖農場 新疆 瑪納斯 832208）

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如何發揮獸醫實驗室檢測的最大效能

胡志剛 楊保華 （新疆生產建設兵團第六師新湖農場 新疆 瑪納斯 832208）

隨著養殖業對生產系統和管理思維的不斷突破，致使規模化養殖場生產體系重心也發生轉變，由以前的以生產性能、疫苗免疫和藥物保健為重點的生產體系轉變為以人才培養、繁育體系和健康管理為重點的生產體系。而生產體系的本質就是如何發現問題、進行決策、解決問題、群體健康預警、評價群體健康狀況是否得到改善，實驗室檢測是重要的技術手段的之一。新時代下，畜牧人已經認識到實驗室檢測在種畜源頭凈化、疾病風險預警、免疫效果評估、疾病傳播控制和協助健康管理等方面的價值。專業的實驗室檢測是一個非常縝密的系統工程，包含檢測前、檢測中、檢測后3個關鍵點。

1 檢測前：樣品背景和樣品統計意義

背景是指所采樣品主體的生產性能、用藥和免疫情況及臨床現狀；樣品統計意義是指所采集樣品要具有統計學意義，可以按生產階段連續性系統采樣(如公豬群、后備母豬群、生產母豬群、仔豬群、保育豬群、育肥豬群)，也可以緊密結合免疫程序采樣(仔豬分周齡，母豬分胎次連續采樣)。重點監測群體和時間點可以按照以下方式進行(以豬為例)：

1.1 生產母豬群 （1）母豬群健康關系仔豬保育期間的成活率：豬場疾病的根源來自于種豬，種豬帶毒、散毒是保育期仔豬難養的根源。（2）適宜母豬群檢測的項目及時間：母豬的檢測應選擇母豬的特殊敏感期，在此階段母豬免疫機能下降，容易發病或向外散毒，適宜檢測的時間及項目有：①防控流行性腹瀉于產前15～20d可采集奶水或肛門處的糞便，通過PCR和接種細胞檢測病原，如果為陽性，可做緊急隔離、疫苗接種或返飼；②配種前后重點監測偽狂犬病毒，配種前后偽狂犬病毒感染可影響胚胎著床，通過抗體檢測可確定配種前是否需要加強免疫偽狂犬疫苗；③種豬凈化：空懷期活體采集扁桃體，檢測豬瘟、偽狂犬和藍耳病原，淘汰帶毒種豬，這對于溫和性豬瘟的凈化尤其重要(我國的種豬的豬瘟帶毒率為8～10%，導致豬場藍耳爆發時形成免疫抑制往往表現為混感豬瘟)；④流產母豬管理：發生流產的母豬檢測臍帶血，如果確定為病毒性疾病導致的流產，短期內禁止配種。隔離至少3個月后再次檢測病原，檢測合格方可使用。

1.2 公豬群 （1）公豬關系生產安全：公豬主要提供優質精液，精液質量影響生產成績。試驗已經證實，部分病毒感染公豬精囊后可導致精液質量下降，如偽狂犬、圓環和藍耳等。此外公豬精液帶毒的還可在配種過程中感染母豬，這在偽狂犬的疾病傳播途徑中表現的尤為顯著，因此需關注公豬精液檢測，檢測方法多用PCR；（2）公豬的檢測時間：公豬應定期檢測，最好每季度檢測一次精液和血清。精液除常規鏡檢外，還需進行病原檢測，如檢測出藍耳，則該公豬3個月內禁止采精；如精液中檢測出偽狂犬病毒，則需堅決淘汰。公豬的偽狂犬檢測應配合血清學檢測，如血清學檢測陽性，但精液病原為陰性，則此公豬需隔離飼養，加大偽狂犬疫苗免疫頻次，預防病原向精囊傳播，但其精液仍可用，不必淘汰該公豬。

1.3 后備種豬群 后備豬群的篩選需將抗體和抗原檢測相結合，但篩選的時間需要做考量，考量標準參照病原的免疫持續期規律。如偽狂犬的母源抗體的持續期可達27個周，在偽狂犬陽性場(但生產基本穩定)的采血時間需要在27周后(因為如果沒有病原中和母源抗體，其母源抗體將持續至27周，因此篩選時應注意區別對待)。其他病毒性疾病也有類似的考量，如藍耳的持續感染期時間較長，病毒血癥期易反復，這些因素均需考慮在內。

1.4 新引進種群 新引進的種群是豬場引進外來病毒的重要途徑，新引進的種群的免疫程序與豬場現階段的免疫程序存在差異(至少存在疫苗產商的差異)，所以有可能新引進的種群在原有的免疫程序下可保護豬群不發病，不散毒，但換用豬場的免疫程序后難以防控。因此對于新引進種群需做好以下工作：（1）嚴格的隔離，至少隔離3個月以上；（2）換用豬場的免疫程序后進行評價，評價合格后才可配種；（3）在一年內禁止混群，直到通過檢測確定不散毒才可以考慮混群飼養；

1.5 保育群 保育期仔豬抵抗力差，是疾病感染高發期，所以在不穩定場不檢測抗體。可以剖殺幾頭發病豬采集病料檢測，提高檢出效率。穩定場保育期間大多數疫苗免疫期已超過一個月，在此期間檢測抗體，評價免疫程序，關鍵評價母源抗體是否產生了干擾，從而調整部分疫苗的免疫程序。

1.6 育肥豬群 育肥豬群是容易被忽視的豬群，此階段豬的抵抗力強，疾病感染后往往不表現出非常嚴重的癥狀，但會影響飼料報酬。舉例說明，偽狂犬對育肥豬的危害主要在呼吸道疾病，導致咳喘，如有類似癥狀在咳喘后5d左右采血檢測，如果檢出病原為偽狂犬，在90～120日齡加強免疫1次，其產生的價值是比未做處理的育肥豬可提前至少5d出欄，經濟效益遠高于疫苗免疫成本。

2 檢測中：系統的質量控制體系

系統的質量控制體系，是保證檢測結果準確可靠地基礎，檢測方法所采納的標準，檢測儀器的合格使用，檢測人員知識架構及技術操作的專業性，檢測人員對診斷檢測試劑的深入理解(根據檢測目的，選擇不同試劑)。實驗室檢測通用的方法及適用范圍如下：

2.1 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) （1）優點：操作簡單，省時快捷，可同時檢測多個樣本，普通養殖場或獸醫站即可考慮配置，對人員素質要求不高；（2）缺點：大部分試劑盒不能區分野毒和疫苗毒；其抗體滴度與具有保護性的中和抗體滴度無絕對線性關系，在藍耳抗體檢測尤為明顯(即檢出的抗體滴度是雜抗體的滴度，意味著抗體滴度高，保護力未必高，這只能作為疫苗免疫后產生免疫力或感染發生的依據)。（3）ELISA的適用范圍：①穩定場的免疫程序評價：如首免日齡的確定，通過抗體檢測可確定母源抗體是否存在干擾及最佳的免疫日齡；②檢測疾病的感染率：適用于未做某種疫苗的疾病的感染狀態評估(偽狂犬除外)。③不穩定場通過檢測抗體判斷是否發病：是可以通過離散度和抗體滴度判定。由于病原感染和疫苗免疫均可以產生抗體，因此當疫情來臨時，通過ELISA不能判定哪些抗體是疫苗產生的，哪些是病原產生的，因此必需結合病原檢測(PCR)結果才能確診。（4）ELISA檢測的注意事項：①抗體檢測需要足夠的樣本數：一般母豬群樣本數至少10%，樣本數過少，隨機性太大，容易誤判；②周期性的抗體檢測數據更有價值：抗體檢測應具有周期性，通過對比近期數據與前幾年同時期的數據，對于豬場的科學決策具有參考價值。

2.2 聚合酶鏈式反應(PCR或RT-PCR)及基因序列測定（1）優點：針對性強、可確診；可區分野毒與疫苗毒；q-PCR可確定病毒載量，確定發病的主因；（2）缺點：操作復雜，需專業人員操作，責任心強；要求較高，專業人員需要有深厚的分子生物學基礎，了解病原的基因結構，此外還需要有方法的支持(針對不同病原，不同基因型的多套可靠的引物序列)。大型規模場從數據真實準確的角度上考慮也需要考慮配置，如不能配置也需要有可靠的合作單位。（3）PCR及測序適用范圍：①疾病診斷，確定多種病原，適用于分析發病的主因；②通過測序可確定病原基因型，便于對癥用苗；對藍耳的免疫尤為重要。（4）PCR及測序注意事項：①不穩定場首先應考慮采用PCR檢測病料；②PCR檢測應保證病料的新鮮，路途較遠時需冷凍后送檢；③檢測時避免污染，實驗室中應有相應的設施確保不出現氣溶膠污染。

2.3 細胞培養相關試驗 體外培養的細胞可以模擬動物試驗體內的結果，也可用于活毒的擴繁、毒價的測定等工作，是未來發展的方向。目前在幾個大集團均有此設施，但該實驗室對潔凈程度和操作人員素質要求特別高，需要生物安全柜和相應的細胞室，可以完成以下幾方面工作：（1）病毒分離鑒定：分離純化病毒，便于進一步分析病毒的致病性。（2）交叉中和試驗：利用分離的毒株進行交叉中和試驗，可更科學地判斷疫苗免疫的中和抗體對豬場分離株的中和效果，其評估的結果優于基因測序比對。（3）血清馴化：比在活體動物上繁殖病毒安全性更高，更穩定。（4）毒價測定：可用于測定疫苗毒價或“返飼”材料的毒價；如流行性腹瀉“返飼”成功要素有以下兩要點：①“返飼”材料純凈，無PCV2和PRV等病原。②毒價確定，“返飼”的病毒量需要滴定，否則母豬返飼后有散毒風險；而這些問題可通過PCR及細胞相關試驗解決。

3 檢測后：檢測數據的分析

對檢測數據的分析，數據分析需要精通專業知識，掌握分析指標。

3.1 專業知識 系統的免疫基礎知識，如首免與二免的作用；母源抗體與半衰期(持續時間)；免疫后產生保護及能檢測到的保護抗體的時間；檢測試劑及其所測指標的意義：（1）豬瘟一免后無一例外地表現出抗體水平下降的趨勢，二免后表現出顯著地保護抗體上升。（2）母源抗體的半衰期：PRVgB抗體一般可維持至8～10周，CSFV抗體4～6周，而PRVgE抗體可以維持至13～16周齡。（3）疫苗免疫保護與抗體消長規律。通常情況下，活疫苗免疫后1～2周產生保護，而2～3周試劑才能檢測到保護指征性抗體，而滅活疫苗分別為2～3周和3～4周。（4）檢測試劑及其所測指標的意義：不同公司的試劑盒，其設計原則及檢測指標的意義不同，不同試劑盒抗體陽性指征性完全不同(即與免疫保護力的關系不同）。例如核衣殼蛋白(N蛋白)包被的藍耳病抗體ELISA檢測試劑盒，檢測早期感染抗體，與SN檢測結果沒有相關性；膜蛋白(M蛋白)包被的藍耳病抗體ELISA檢測試劑盒；與IFA 或者IPMA方法相似，與SN抗體有一定的相關性，可在一定程度上反應免疫保護效果。

3.2 分析指標 主要從免疫評估和群體野毒感染/壓力監控兩方面分析。（1）免疫評估包括抗體陽性率、抗體水平(抗體平均值，群體內個體分布)及離散度。離散度在某種程度上比抗體水平更重要，一般情況下要控制在30%～40%，它反應疫苗免疫的均一性及操作的穩定性。（2）群體野毒感染/壓力抗體監控：使用特異的抗體鑒別檢測試劑盒(PRVgE抗體及FMDV3ABC抗體)；抗體水平異常高，離散度大，提示群體有感染風險；通過連續的跟蹤監測(至少2～3次/年)和調整，設立養殖場的免疫基底線，離散度及抗體水平的突然異常作為養殖管理異動的信號，低于基底值，說明免疫有問題(疫苗、程序、操作等)，高于基底值，可懷疑感染。

總之實驗室檢測是一項系統工程，需要嚴格規范的硬件和軟件條件，如機構的設備、實驗室的環境、質量的品控、人員操作、專業的檢測試劑等，而且檢測的數據分析一定要與臨床相結合，光看原始數據，非結合臨床實踐得出的檢測數據是沒有意義的。規模場可以籌建適合自身發展需要的實驗室或與可靠實驗室建立合作，發揮獸醫實驗室檢測的最大效能。

收稿日期：（2016–01–07）

中圖分類號：S851.33

文獻標識碼：B

文章編號：1007-1733(2016)03-0042-03