物種鑒別方法研究進展

朱曉敏

(朝陽市獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧朝陽 122000)

物種鑒別方法研究進展

朱曉敏

(朝陽市獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧朝陽 122000)

在動植物檢驗檢疫事業、法醫物證鑒定、物種系統發育、疾病診斷等研究中，不明來源的生物檢材的種屬鑒定是一個重要的鑒定環節，傳統的物種鑒別方法依賴于形態學方法、解剖學方法及化學分析法，但由于環境因素的影響以及生物發育不同階段的差異，這些方法顯示出了局限性，為了克服這些缺點，許多基于基因分型的分子鑒別手段相繼問世，本文對近年來應用于物種鑒別的形態學方法、免疫學方法、分子生物學方法、高效液相色譜法、近紅外光譜法(NIRS)等研究方法作以綜述。

物種鑒別；形態學；免疫學；分子生物學；高效液相；近紅外光譜

目前，物種鑒別是我國重點研究的專項之一，物種范圍廣泛，從微觀細菌到宏觀的自然界，保護物種資源，不破壞生態環境，是研究的主要目的，但隨著經濟的發展，自然受到了巨大的破壞，物種在進化過程中也發生了巨大的、驚人的變化，研究物種鑒別的方法，在疾病診斷、物種分類學、流行病學、醫療及社會經濟領域都將發揮重要作用。

傳統的物種鑒別方法依賴于形態學方法、解剖學方法及化學分析法，但由于環境因素的影響以及個體發育不同階段的差異，這些方法顯示出了局限性，為了克服這些缺點，許多基于基因分型的分子鑒別手段相繼問世，本文對近年來應用于物種鑒別的研究方法作以綜述。

1 形態學方法

形態學方法最早用于種屬鑒定，如根據紅細胞有無細胞核，可以區分人類與鳥類。應用較多的是根據人類與其他動物的毛發、骨骼在大體形態和顯微鏡下結構差異，達到種屬鑒定的目的。

對于飼料中動物源性成分的鑒別，運用顯微鏡法可對備檢樣品進行結構和形態學觀察，低倍鏡下沉淀物的結構和顏色是鑒別肉骨粉來源的第一信號，如哺乳動物的骨碎片呈白色或淡黃色，而禽類的顏色發暗且尖銳，高倍鏡下哺乳動物骨碎片橢圓，禽類的骨碎片尖銳等。運用顯微鏡法鑒別物種，具有樣品制備量少，設備便宜、簡單易行等優點，但此方法費時費力，對技術人員的要求高，結果與實驗員的經驗相關性很大。

目前，計算機在運算速度和存儲容量方面迅猛發展，使其在物種鑒別與鑒定方面發揮作用成為可能。國外自20世紀50年代起就開始運用計算機技術進行昆蟲模式識別方面的探索，Yu等（Yu D.S.，1992）使用半自動的圖像分析技術對姬蜂翅脈進行了測量，并成功區分5個種，成功率達到了100%.中國農業大學沈佐銳教授指導IPMist實驗室利用計算機模式識別手段進行昆蟲種類鑒定，利用數字圖像技術對昆蟲圖像分割進行了較全面的研究，利用神經網絡對昆蟲進行自動鑒別在昆蟲形態自動測量與種類自動鑒定方面取得了一系列進展。

2 免疫學方法

血清學方法是種屬鑒定的經典方法，根據不同物種蛋白間理化性質差異，通過檢測檢樣中是否有種屬特異性蛋白質來達到種屬鑒定的目的，包括：沉淀反應，凝集反應，酶免疫分析，等電聚焦，高效液相色譜技術及纖維蛋白溶解實驗等其中環狀沉淀反應方法簡便，是目前常規檢驗方法之一。

3 分子生物學方法

無論是法醫現場檢材還是食品藥品監督和海關打擊走私的生物檢材，種屬鑒定的對象很多是微量甚至是混合性檢材，因此常需采用分子生物學技術進行種屬鑒定。用于物種鑒別的分子生物學方法主要包括限制性片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增多態DNA（RAPD）、PCR特異性鑒定等。

4 高效液相色譜法

許多病原菌其致病性差異很大，但這些細菌其他特性及遺傳基因都非常相似，變性高效液相色譜法（DHPLC）技術通過利用通用PCR引物擴增細菌的165核糖體RNA基因中的高度變異序列的片段，將這些來自不同種類或菌株的具有細微差異的DNA序列的細菌的擴增產物與參考菌株的擴增產物混合后進行DHPLC檢測，根據所產生的獨特的色譜峰圖，可以作為細菌種類的分子指紋，從而可以從菌株水平鑒別病原菌。劉朝暉等運用變性高效液相色譜（DHPLC）技術對從肺炎克雷伯氏菌臨床分離株產超廣譜β-內酰胺酶（ESBL）的TEM型質粒PCR擴增的編碼序列進行分析，48.6%的樣本表現為異常洗脫峰，經測序、NCBI網站比對及文獻檢索，確定了一種TEM型質粒的新基因亞型TEM-116，為國內首次報道。

5 近紅外光譜法（NlRS）

在植物藥的種類鑒定方面，紅外光譜已有廣泛應用，具有制樣簡單，實驗快速，譜圖特征顯著和重現性較好等特點。萬定榮等對10種卷柏屬藥用植物樣品的紅外光譜比較研究證實，利用光譜圖中的整體峰形及吸收峰的數目、位置（Cm-1），強度與峰強比率等特征，尤其是指紋區（1250-400 cm-1）的上述特征，可對各個種進行有效的輔助鑒別，還可用于藥用植物或植物藥材不同產地、生境樣品的鑒別分析，比較近緣種間的親緣程度。

目前NIRS已在肉類食品鑒別中開始應用，可以定量分析食品真偽，但僅有少數的研究報道利用NIRS肉類品種的鑒別，研究主要集中在區分牛肉、雞肉、羔羊肉和牛肉的混合，以及對于牛肉、豬肉和雞肉間的區分。NIRS主要利用樣品的光學特性，利用反射，能見度或纖維光學特性區分肌肉的種類，是一種快速、有效預測不同動物品種肉類組分的方法。

綜上所述，運用各種技術手段進行物種的鑒別與鑒定，在法醫學實踐和打擊走私動物的活動中將發揮重要作用，同時，建立有效的物種鑒別方法，為防止瘋牛病、禽流感等重大疫病的發生與傳播具有非常重要的意義，通過物種鑒別揭示動植物自然居群、品種中遺傳結構的基因流動與演變等系統發育與親緣關系的真實本質，對于保護地方動植物物種資源，鑒別珍稀動植物物種，珍稀動植物資源的開發與利用，促進動物養殖業的發展等也將發揮重要作用。

[1] 李帥英，吳增志，李保會.物種多樣性研究進展[J].河北林果研究，2002，17（1）：72-79.