基于間接ELISA檢測方法新生仔豬流行性腹瀉病探析

古正賢

(四川省內江市威遠縣高石鎮畜牧獸醫站，四川內江 642450)

基于間接ELISA檢測方法新生仔豬流行性腹瀉病探析

古正賢

(四川省內江市威遠縣高石鎮畜牧獸醫站，四川內江 642450)

本文為探析新生豬仔的流行性腹瀉病毒，構建豬流行性腹瀉病毒蛋白間接的ELISA檢測方法，從新分離PEDV流行毒株中擴增其N基因，并將N基因克隆至DNA原核表達載體中構建重組質粒，經過誘導的重組蛋白呈可溶性表達。將純化的N蛋白作為包被抗原建立ELISA檢測方法，并且對各種檢測條件進行優化優化后確定N蛋白最佳包被條件為37度，該間接ELISA方法為PEDV診斷和流行病學調查提供了有益參考。

新生仔豬；流行性腹瀉；病理；DNA原核

1 前言

在國內，盡管導致新生仔豬腹瀉的病因很多，但2011年至今以來，學者從表現為嘔吐、水樣腹瀉、迅速脫水、高死亡率為特征的新生仔豬樣品中分離到了PEDV。因此，我們可以認為：PEDV是近年來引起新生仔豬腹瀉最重要病原。PEDV的N蛋白具有良好的抗原反應性，是制備診斷試劑的主要蛋白。PEDV抗體檢測有血清中和試驗、免疫電鏡觀察（IEM）、間接血凝試驗（IHA）、免疫組織化學技術、免疫熒光、原位雜交法、RTPCR、ELISA等。目前市面上尚無商品化的PEDV ELISA檢測試劑盒，因此建立PEDV抗體ELISA檢測方法具有一定現實意義。

2 實驗方法

提取病毒基因組RNA，反轉錄合成cDNA，用引物N．F、N．R擴增全長N基因，PCR體系方法參照第二章。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收膠產物后，送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序正確的產物與用XhoI酶切后載體pCold-I DNA 各100 ng，用5xIn-FusionHD Enzyme Premix 50℃連接15 min后轉化DE3感受態細胞，具體步驟如下：（1）將連接產物全部加入在冰上剛剛溶解的感受態細胞中，冰浴30 min；（2） 再放入4℃水浴鍋中，熱激45 S，再冰浴3 min；（3）在無菌操作臺中，將冰浴后的產物加入裝有1 ml無抗的LB培養基的管中。置于搖床中，200rpm/min37℃震蕩1 h；（4）取出EP管，于離心機中4000 rpm離心2 min，棄液保留100L液體；（5） 用槍吹打均勻，于無菌操作臺中均勻涂布于含氨芐抗性的LB瓊脂平板上。37℃培養14～16 h挑取菌落置于含有氨芐的2YT培養基中，搖菌，PCR鑒定重組表達質粒否正確，提取PCR鑒定正確的質粒，具體步驟：選取N基因克隆陽性菌液，按OMEGA公司質粒抽提試劑盒的說明抽提質粒。

3 間接Elisa方法的建立及實驗結果探析

3.1 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定

將N蛋白稀釋成不同濃的度進行包被，PEDV陽性血清和陰性血清分別從50倍到400倍稀釋，方陣滴定結果顯示，抗原的最佳包被量為 200 mg/L，血清的稀釋度為1：200，此時的陽性血清與陰性血清的OD450 11121值相差最大（P/N=9.736）。

3.2 最佳包被液、最佳封閉液及封閉時間的優化結果

用不同包被液以包被酶標板，用不同的封閉液對包被的酶標板按不同時間進行封閉，試驗結果表明，用O．05 M碳酸鹽包被液包被抗原，5%脫脂乳37度封閉2 h時，P/N值最大。此時為最佳條件。

3.3 血清與酶標二抗的最佳作用時間的優化結果

按上述確定條件進行實驗，將血清按20 min、30 min、45 min、60 min四個時間段作用，洗三次后，將稀釋好的酶標二抗按20 min、30 min、45 min、60 min四個時間段作用，根據OD450測定結果，計算P/N值，確定最佳血清孵育時間為20 min，最佳二抗孵育時間為60 min。

3.4 顯色溫度與時間的優化

按上述條件實驗，最后顯色時，分別用室溫和37℃，顯色時間為5 min，10 min，15 min，進行ELISA測定，分析實驗結果表明，37℃顯色15 min，為最佳底物顯色溫度時間，此時P/N值可達21.760。

4 結果與討論

PEDVN蛋白是一種磷酸化的核衣殼蛋白，它與基因組RNA緊密結合，是PEDV中所占比例最大的一種結構蛋白，且其高度保守，具有良好的抗原反應性和特異性。能誘導機體快速產生較高水平的特異性抗體，可作為PEDV早期感染的診斷依據。在文中我們成功分離到了一株PEDV流行毒株SH6，由于目前國內外對PEDV研究尚不深入，對該病的準確監測仍存在技術難關，因此，建立實用的PEDV實驗室檢測方法迫在眉睫。酶聯免疫吸附試驗是一種常用的經典血清學檢測方法，它操作簡便、靈敏度高，特異性強。目前市面上有一些以全病毒抗原為基礎的商品化PEDV檢測試劑盒，但該病毒不易分離培養，因此難以制備大量抗原。此外，這些ELISA試劑盒還可能存在排散病毒的隱患。本研究擴增其N基因，以pCold．I DNA作為原核表達載體，構建pCold-I-N重組質粒，并將其轉化感受態細胞BL21（DE3），目的蛋白在上清液中高效表達。采用NioNTA柱對重組蛋白進行純化，得到濃度為1.5 mg／mL的目的蛋白。Westernblot分析表明該蛋白具有良好的抗原反應性。利用純化的重組蛋白，初步建立問接ELISA檢測方法，優化各項反應條件。問接ELISA優化后條件為：最佳包被液O.05 M碳酸鹽緩沖液（pH 9.6），最佳抗原包被量為200 ng/孔，最佳包被條件為374C包被2 h，最佳封閉條件為5%脫脂乳37度封閉2 h，最佳血清稀釋度為1：200，血清最佳孵育時間為37度孵育20 min，二抗最適稀釋度為1：2x104，二抗最佳孵育時間為40 min，臨界值為＞0.394時判定為陽性，OD450 rim_＜0.345時判定為陰性，0.345～0.394為可疑。并對50份已知背景血清進行檢測，符合率達94%。

[1] 呂茂杰，陳建飛，時洪艷，等.豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白與感染細胞核磷蛋白的共定位分析[J].微生物學報，2011，51 （5）：643-647.