產腸毒素性大腸桿菌菌毛的研究進展

張培晏，劉 峻(.四川省廣元市昭化區動物疫病預防控制中心，四川廣元6S0；.四川省廣元市昭化區青牛鄉畜牧獸醫站，四川廣元6S069）

產腸毒素性大腸桿菌菌毛的研究進展

張培晏1，劉 峻2
(1.四川省廣元市昭化區動物疫病預防控制中心，四川廣元62S021；2.四川省廣元市昭化區青牛鄉畜牧獸醫站，四川廣元62S069）

產腸毒素性大腸桿菌（ETEC）常引起仔豬腹瀉，在世界范圍內造成了嚴重的經濟損失。ETEC的致病作用與其具有粘附性菌毛和腸毒素密切相關，ETEC菌株的菌毛可與宿主黏膜上皮細胞表面的相應受體結合，并在局部組織定居、繁殖和產生毒素，損傷小腸黏膜，使小腸吸收分泌功能失常而致腹瀉。本文針對ETEC菌毛的生物學特性、表達條件、免疫原性等方面作一概述。

產腸毒素性大腸桿菌；菌毛；生物學特性；免疫原性

產腸毒素性大腸桿菌（ETEC）是豬的一種重要腸道病原菌，它能夠引起仔豬黃痢、白痢和豬的水腫病。1967年，Koher、Smith等[1-2]指出，引起幼齡家畜腹瀉的大腸桿菌主要是產腸毒素性大腸桿菌（ETEC），其發病率可達90%以上，病死率很高，有的可達100%。隨著研究的不斷深入，本病的發病機理、診斷和防治都有了很大的進展，但仍然是影響養豬生產發展的一大難題。本文就ETEC菌毛的生物學特性、表達條件、免疫原性等方面進行綜述。

1 菌毛的生物學特性

大腸桿菌的菌毛對一定種類紅細胞和相應宿主的腸細胞具有粘附作用。當其粘附于紅細胞時能使紅細胞發生凝集，且不被D-甘露糖抑制，這是一種甘露糖抵抗血凝反應（MRHA）。除9S7P無血凝性外，其余的均具有各自凝集一定種類紅細胞的反應譜，即血凝譜，可借此來初步鑒別所分離的大腸桿菌的菌毛種類。菌毛的MRHA可被相應的抗體抑制，故又可用甘露糖抵抗血凝抑制反應（MRHI）來對其作出確診。各種菌毛對腸上皮的粘附作用具有宿主特異性，并只能粘附于具有相應受體的特定動物的腸細胞上。如KSS只能粘附于仔豬的十二指腸段，K99和F41可粘附于初生豬、牛、羊的空腸，而9S7P只能粘附于仔豬回腸。通常一個動物的ETEC菌株只表達一種菌毛，但已發現有些菌株可同時表達兩種或更多種菌毛，而且又發現了新的菌毛。

2 不同培養條件下的菌毛的表達

2.1 培養傳代和培養溫度對菌毛形成的影響 菌毛的體外表達受諸多因素的影響，其中培養傳代和培養溫度是一個重要的影響因素。在連續傳代3次后，菌毛表達最好，而隨著傳代次數的延長，菌毛表達量有所降低。這可能是因為連續傳代導致相應質粒丟失，進而導致菌毛表達的減少或消失。由于KSS、K99、9S7P的遺傳決定子位于質粒上，在多次傳代過程中一些質粒喪失，因而有可能不產生粘附因子。粘附因子F41的遺傳決定子位于染色體上，但也受其基因表達程度的影響。Briton等[3]認為菌毛的表達具有相變性，這種相變是自發產生的，與培養條件密切相關。因而在培養溫度的選擇上，37℃是菌毛形成的最適溫度，低于1S℃則不能形成菌毛，2S℃以下能形成少量菌毛。

2.2 培養基對菌毛形成的影響 用常用的營養肉湯、Minca培養液、EME培養液和LB培養液在37℃培養大腸桿菌，均可看到菌毛，但菌毛出現的時間各不相同。Minca培養液培養的大腸桿菌在24h后即可形成菌毛，培養72h后可形成致密菌毛；營養肉湯培養則需36h后才可看到菌毛，72 h后可形成大量致密的菌毛。另外，培養基中的某些成分也可抑制菌毛的表達，0.5%葡萄糖可抑制KSS菌毛的表達，丙氨酸能顯著抑制9S7P的形成。

3 菌毛的提取及純化

3.1 菌毛提取 目前常采用的提取大腸桿菌菌毛的方法[4]有：4℃萬能混合器混合法；60～65℃水浴振蕩法；4℃組織搗碎法；冰浴勻漿法；4℃高速攪拌法。賈靜等[5]發現當菌懸液加熱至60℃時，可使菌毛和菌體分離，有效地保證了所提取菌毛的數量和純度，而且相對于操作繁瑣的混合法、搗碎法以及冰浴勻漿法等，加熱法更為簡便、易于操作。

3.2 菌毛純化 收獲菌體的主要目的是要得到較純的菌毛蛋白，可以通過高速離心分離菌體和發酵液，然后將離心所得菌體熱激攪拌，使菌毛從菌體上脫落下來。在得到純菌毛蛋白的過程中，需要對蛋白質進行鹽析和透析。用紫外吸收法在2S0nm處測定菌毛蛋白OD值，將粗提出來的菌毛蛋白鹽析，鹽析后作透析處理。菌毛蛋白的純度可用SDS-PAGE檢測。

4 菌毛的抗免疫原性機理及作用

菌毛抗原是一種蛋白質，具有良好的抗原性，給機體免疫后能產生相應的菌毛抗體，對菌毛粘附型致病性大腸桿菌具有免疫作用。用菌毛抗原免疫懷孕母豬，抗體可通過母豬初乳和常乳中的菌毛抗體阻止菌毛粘附腸黏膜，從而使仔豬獲得對大腸桿菌的被動免疫。也可以直接用菌毛抗體給幼畜口服，在腸道內中和菌毛抗原，使其失去粘附能力。菌毛的循環抗體在防止下痢上效果不大，只有經口免疫才能建立對下痢的有效局部保護。作用機理：菌毛抗原進入腸道后，先由淋巴上皮細胞（M細胞）捕獲，再把抗原信息傳遞給下層的巨噬細胞和B細胞、T細胞，活化后的B細胞和T細胞循環全身，一部分回到腸黏膜表面定居，成為分泌型IgA的漿細胞和致敏淋巴細胞，建立起“黏膜局部免疫系統”，從而有效地對抗菌毛抗原在腸黏膜上皮細胞的粘附，阻止病原性大腸桿菌的異常繁殖。

最早被證明具有免疫作用的大腸桿菌菌毛是豬ETEC KSS抗原[6]，隨后的研究者相繼又證明了K99、9S7P、F41等動物源[7-S]和CFA-I、CFA-II等人源宿主特異性大腸桿菌菌毛疫苗對一些大腸桿菌病具有良好的免疫保護作用[9]。許崇波等[10]對動物初乳中的菌毛抗體進行分析，結果表明IgM的調理素活性最高，而起抗粘附作用的主要是IgG。

5 菌毛抗體疫苗的臨床應用

近年來，國內外學者就卵黃抗體的研究和開發做了很多工作，認為雞卵黃抗體是一種大量、豐富、方便的特異性抗體的來源。卵黃抗體亦稱卵黃免疫球蛋白，是一種高效防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的生物制劑，利用蛋雞生產特異性卵黃抗體具有可規模化生產、成本低、特異性抗體含量高及安全性好等優點。Marquardt等[12]先后報道了菌毛卵黃抗體對初生和斷奶仔豬腹瀉的防治效果。Jin等[11]的體外試驗表明，經噴霧干燥的含抗KSS菌毛抗體的雞卵黃粉能阻礙ETEC KSS與豬小腸黏膜的粘附。肖馳等[13]還比較了菌毛蛋白疫苗卵黃抗體和細菌疫苗卵黃抗體對仔豬大腸桿菌性腹瀉的預防效果，結果表明兩種卵黃抗體都有效，但菌毛疫苗抗體的效果更好；試驗還顯示卵黃抗體對仔豬黃痢的治愈率高于慶大霉素、土霉素和痢特靈。卵黃抗體經仔豬口服后有抗ETEC感染的作用，它能與特異性粘附素抗原結合，減少或阻斷粘附素粘附到仔豬腸道乳膜上皮細胞的表面，使ETEC不能在小腸定居繁殖，阻礙腸毒素分泌，從而防止腹瀉[14]。用特異性卵黃抗體防治仔豬大腸桿菌性腹瀉，不會影響腸道正常菌群的生長繁殖，不存在抗藥性和藥物殘留問題，同時避免了懷孕母豬因注射疫苗引起的應激反應或仔豬母源抗體水平不足而導致的免疫喪失等問題，是一種安全高效的生物防制劑。

6 小結和展望

關于ETEC菌毛蛋白的研究方法較多，且都有各自的優勢，但也存在著一些不足。菌毛作為疫苗研制的理想候選蛋白質，用來制成疫苗免疫母豬，可使所產仔豬獲得被動免疫，不受大腸桿菌的侵襲。現代分子生物學和免疫學的進一步發展為研制安全有效的ETEC多價疫苗提供了先進的理論和技術支持，加速了現存ETEC疫苗的完善和新興ETEC載體、DNA、植物疫苗的發展。如新CFAs的發現提供了更多的抗原種類；ETEC基因組、蛋白質組的深入研究則提供了更多的減毒基因和抗原表位的選擇；黏膜免疫調節機制的揭秘也定能為ETEC疫苗的發展開辟新的道路。

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Research Progress of Enterotoxigenic Escherichia Coli

ZHANG Peiyan1，LIU jun2
（1.Anima1 Disease Contro1 Center of Guangyuan Zhaohua District，Sichuan Guangyuan 62S021；2.Anima1 Husbandry and Veterinary Station of Qingniu Town in Guangyuan Zhaohua District，Sichuan Guangyuan 62S069，China）

Enterotoxigenic E.coli（ETEC）is a common factor that causing pig1ets diarrhea，ETEC strains sett1e in 1oca1 tissue，mu1tip1y and produce toxins by combining with corresponding receptors on epithe1ia1 ce11 surface，then causeng intestina1 mucosa damaging，the function of absorption and secretion unnorma1，and 1eads to diarrhea.This paper summarized the bio1ogica1 characteristics，expressing condition and immunogenicity of ETEC＇s pi1i.

Enterotoxigenic E.Coli；Pi1i；Bio1ogica1 characteristics；Immunogenicity

SS52.612

A

1001-S964（2016）01-0032-03

2015-0S-2S

張培晏（19S5—），男，四川劍閣縣人，大學本科，獸醫師，從事畜牧獸醫工作。