流式細胞儀在檢測食品中微生物的應用研究

何方洋　萬宇平　賈芳芳　吳小勝　羅曉琴　（①北京勤邦生物技術有限公司北京 昌平　102206　①北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心）

文獻綜述

流式細胞儀在檢測食品中微生物的應用研究

何方洋①①萬宇平①①賈芳芳①①吳小勝①①羅曉琴①①（①北京勤邦生物技術有限公司北京 昌平102206①北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心）

流式細胞儀（flow cytometer）是流式細胞術的商品化應用，它作為新型高科技儀器，已應用于臨床醫學、微生物學、海洋、漁業、釀酒、畜牧、體育科學、農業、林業、化工等領域，本文著重介紹了目前流式細胞儀在檢測食品中微生物的應用研究。

流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）是一項細胞分析技術，不僅能夠快速定量分析和分選液流系統中單個細胞或其它生物微粒，而且可以實現分類收集特定細胞或細胞器。流式細胞儀（ flow cytometer）是流式細胞術的商品化應用，它作為新型高科技儀器，已應用于臨床醫學、微生物學、海洋、漁業、釀酒、畜牧、體育科學、農業、林業、化工等領域，隨著科學技術的發展，流式細胞儀在檢測食品中微生物方面應用發展起來［1］。檢測食品中微生物是評價食品衛生的一個重要指標，目前發布的國家標準、行業標準以及地方標準中涉及到的食品中微生物的檢測方法主要有：交叉引物恒溫擴增檢測方法、環介導恒溫核酸擴增（LAMP）法、免疫磁珠法、分子分型SPA基因分型方法、熒光PCR法、Baird-parker瓊脂培養基計數法、電泳和免疫印跡法、免疫色譜反應法、酶聯免疫法等［2-10］。隨著人們對食品安全要求的提高，相對于其他檢測手段，流式細胞術已成為一種被認可的重要分析技術，利用細胞能夠自發熒光，并且標記不同的熒光素（蛋白、核酸等），流式細胞儀通過散射光可以在流動的狀態中檢測細胞各種物理及生物特征。

1　流式細胞儀結構、原理及機型

1.1流式細胞儀結構流式細胞儀主要由五個部分組成：流動室和液流系統；激光源和光學系統；光電管和檢測系統；計算機和分析系統；細胞分選系統［11-13］。其中，流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，是液流系統的心臟。

1.2流式細胞儀原理由于超聲振蕩器產生高頻振蕩，使流動室發生振動，因此，能夠把噴嘴噴出的細胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，其中部分液滴含有細胞。在待測細胞形成液滴前，光學系統已測定出細胞的性質，如果發現了目標細胞，則在該目標細胞剛形成液滴時，儀器給整個液流充以短暫的正電荷或負電荷。當該液滴離開液流后，其中目標細胞的液滴就帶有電荷，而其他細胞的液滴則不帶電。帶有正電或負電的液滴通過高壓偏轉板時，會發生向陰極或向陽極的偏轉，從而達到了分類收集細胞的目的。整個儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號和光散射信號，測定的結果用單參數直方圖、雙參數散點圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來表示［14-16］。

1.3流式細胞儀基本機型目前，主要生產流式細胞儀的公司有德國的Partec公司、美國的BD公司和貝克曼庫爾特公司［17-18］。儀器主要分為臨床分析型和科研分選型，前者主要應用于臨床實驗室，后者則適于廣泛的科研領域。隨著電子制造技術、計算機技術、熒光素合成等技術的發展，流式細胞儀開始向模塊化發展，其電子系統、光學系統、檢測器單元等均可以按照試驗要求隨意更換［19-20］，以滿足用戶的不同需求。

2　流式細胞儀在食品微生物檢測方面的應用

流式細胞儀曾經在第二次世界大戰中用來檢測細菌和孢子，后來隨著流式細胞儀的商業化發展，用來檢測哺乳類生物細胞，直到上世紀90年代末，由于儀器光學系統的改進，以及新熒光素的發現，流式細胞儀在微生物學的應用快速發展起來。而在食品工業應用中，流式細胞儀已被應用于釀酒、面包發酵、飲料等行業［21-23］，它已成為微生物檢測的常用工具。

2.1應用于細菌活性的判斷流式細胞儀能夠鑒定食品中微生物的活性，因為活細胞具有完整的細胞結構，一般的熒光染料無法進入，只能進入細胞膜受損的細胞中。而有些染料可以進入所有死細胞和活細胞內，其進入量有差別。如果將兩種特性的染料結合應用，配合熒光微球，即可快速鑒別并計數死/活細胞。該特性既可以評價食品的殺菌效果，也可以評價食品中有益菌的含量［24-26］。

2.2應用于食源性致病菌的檢測目前，已有學術研究報道利用流式細胞儀檢測生乳、果汁等食品中致病菌數量，這些報道同時也比較了平板計數法，結果發現流式細胞儀檢測時間只需2h左右，而平板計數法則需要5d左右，而且在一定濃度范圍內，前者具有更好的符合性，更加靈敏、準確、高通量，對液態食品的貨架期、倉儲、保質期、出口等順利進行提供了高效的技術平臺［27-29］。而在現實生活中，食品的生產、運輸、消費過程均存在微生物污染的可能，食源性疾病是食品安全中最突出的問題，流式細胞儀已成為檢測霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門氏菌等多種病原菌的有力手段［30-32］。

2.3應用于食品中微生物的在線檢測流式細胞儀能夠檢測食品中目標微生物的數量，能夠同時檢測多個樣品，大大縮短了檢測時間，因此滿足了批量樣品的在線檢測需求。有人設計了一種低通量的流式細胞儀檢測系統，能夠實時、在線監測生物反應器中菌體生長的變化過程。與其他熒光檢測方法相比，只有流式細胞儀可以從大量弱熒光信號的菌體中辨別出少量熒光信號強的菌體，由于流式細胞儀能夠提供精確、可靠的檢測結果，因此可以從中選擇穩定的高產量理想菌株［33-35］。

3　結論與展望

流式細胞儀的使用解決了一些傳統檢測手段的缺點，比如檢測周期過長，無法大批量檢測樣本［36-37］，流式細胞儀能夠保持細胞結構、功能不被破壞，通過熒光探針的協助，從分子水平上獲取多種信號，對細胞進行定量分析或純化分選，目前已成為食品中微生物質量檢測的一種有力手段。然而，流式細胞儀在食品領域中的應用僅是冰山一角［38-42］，隨著科學技術的發展，流式細胞儀的功能將越來越強大，逐步向儀器小型化，操作自動化的方向發展。

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