哺乳動物抗菌肽的研究進展

蘇華鋒　雷 戰　郭中坤 （山東省鄄城縣畜牧局　274600）李 浩　李建梅　趙 元　李蘭波　（山東省醫學科學院　山東省實驗動物中心　濟南）

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哺乳動物抗菌肽的研究進展

蘇華鋒雷 戰郭中坤 （山東省鄄城縣畜牧局274600）李 浩李建梅趙 元李蘭波*（山東省醫學科學院山東省實驗動物中心濟南）

抗菌肽(Antibacterial peptide)是生物體用來抵御外來病原入侵而產生的具有抗菌作用的一類小分子蛋白質，具有分子質量小、對熱穩定、水溶性好、廣譜抗菌和作用機制獨特等特點。本文主要對幾種哺乳動物抗菌肽研究概況及其開發應用前景做一綜述。

抗菌肽是生物長期進化過程中保留的先天免疫系統或原生宿主防衛機制中重要的活性分子，是具有抗菌活性的肽類的總稱[1]，是哺乳動物防御系統的一個重要組成部分，具有熱穩定、水溶性好、廣譜殺菌甚至有的能殺真菌、原蟲等優點，而且許多抗菌肽在100℃加熱10min條件下仍能保持一定活力，對較大的離子強度和較低或較高的pH都有較強的抗性。迄今為止，人們已從生物界分離得到2000多種具有抗菌活性的多肽[2]，它們分布極廣，從病毒、細菌、真菌、兩棲動物、軟體動物、魚類、鳥類到昆蟲、哺乳動物均有發現。

1　抗菌肽的分類

哺乳動物抗菌肽主要存在于中性粒細胞及皮膚和黏膜的上皮細胞，哺乳動物抗菌肽主要分為兩大類，即防御素(defensins)和cathelicidins。其中研究最多的防御素類抗菌肽，是抗菌肽家族最大的一類，哺乳動物防御素分為α-defensins和β-defensins兩大類。

1.1兔源抗菌肽1980年洛杉磯Leherer實驗室首次從兔肺巨噬細胞中發現兩個陽離子性極強的小分子抗菌肽[3, 4]，富含Cys殘基的防御素，其后又發現一系列一級結構相似的小肽分子，命名為Defensins，其后國內外已有學者分別由兔嗜中性粒細胞、兔腎等細胞或器官中分離出了抗菌肽類物質[5,6]，并且這些抗菌肽類物質均表現出較強的抗菌活性。佘銳萍等[7]已從兔腸道組織的特殊結構圓小囊組織中分離到一類抗菌肽類物質，實驗證明這類抗菌物質有較強的抗菌活性和較廣泛的抗菌譜。2005年王可洲使用乙酸提取法從兔小腸組織中分離得到一種純的兔腸源抗菌蛋白[8]，其相對分子質量約為43×103的抗菌蛋白，用瓊脂糖彌散法和活菌計數試驗檢測純化物對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、白色葡萄球菌均具有較強的抗菌活性。

1.2豬源抗菌肽（1）1989年Lee等首先從豬小腸分離出得到抗菌肽cecropin P1[9]。ceceopin P1含有31個氨基酸殘基，分子量是3339 Da不含半胱氨酸(Cys)，不能形成分子內二硫鍵，有強堿性的N端和強疏水性的C端，C末端酰胺化，酰胺化的C端對其廣譜抗菌作用極為重要。Agerberth等[10]1991年首次從豬小腸上端分離得到的豬抗菌肽PR-39，PR-39只含有7種氨基酸，含有較高比例Pro(45%~ 49%)和Arg(24%~29%)。另外，從豬肝臟中分離得到βPR-39與PR-39相差3.6%。PR-39由39個氨基酸殘基組成，相對分子量4719Da，具有廣譜抗菌活性，它在動物的機體免疫上發揮著重要的作用。（2）豬抗菌肽Prophenin是從豬白細胞中分離得到的抗菌肽[11]，它也是一種富含脯氨酸和苯丙氨酸的抗菌肽。其中，脯氨酸含量占總氨基酸的57.1%，苯丙氨酸含量也較多(19.0%)。目前從豬白細胞中分離得到的Prophenin有兩種：Prophenin-1和Prophenin-2，兩者之間的差異體現在其氨基酸組成上，它們的第17個氨基酸殘基不同，Prophenin-1的第17號氨基酸為苯丙氨酸，Prophenin-2為纈氨酸。Prophenin-1的分子量為8683Da，含有79個氨基酸殘基，其中含有42個脯氨酸殘基和15個苯丙氨酸殘基。體外試驗發現，Prophenin-1對大腸桿菌有較強的殺菌活性。（3）N K-lysin是從豬小腸純化得到的，含有78個氨基酸殘基，并從豬骨髓cDNA文庫中分離得到它的克隆，有3個分子內二硫鍵，對N K-lysin敏感型鼠腫瘤細胞YAC-1有顯著的裂解活性，但不裂解紅細胞。它與同樣具有三個二硫鍵的defensins不存在關系 。另外，專家們還從豬白細胞中分離得到5個小分子抗菌肽，它們含有16~18氨基酸殘基。馬衛明等[12]采用凝膠過濾層析方法，純化得到具有抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的豬小腸抗菌肽類似物。

1.3牛抗菌肽（1）至今已發現至少38種牛抗菌肽，包括陽離子性的防御素(defensins)和cathelicidins、陰離子抗菌肽及牛乳鐵素。1991年Diamond G等[13]從牛的氣管黏膜上皮細胞中發現TAP。TAP前原肽(prepro-peptide)有64個氨基酸，包含20個氨基酸的信號肽和1個短的前序列(FTQ GVG)。（2）從牛舌上皮分離的LAP含42個殘基，其前原肽由64個氨基酸組成，包含20個氨基酸的信號肽和2個殘基的前序列(phe-thr)。LAP在消化道、呼吸道、乳腺上皮和結膜均有表達[14]。（3）Selsted等[15]從牛中性粒細胞中分離到13種BNBDs。BNBDs包含38~42個殘基，5ku左右，高度陽離子性。大多數BNBDs對大腸桿菌ML35和金黃色葡萄球菌502A的MIC值約為10μg/ml。（4）EBD在牛的小腸末端和結腸中高水平表達[16]。在腸內隱孢子蟲(Cryptozoite)的誘導下，腸道中EBD mRNA的表達量升高5~10倍，表明EBD在抗寄生蟲感染中發揮了重要作用。（5）cathelicidins是一類存在于多種哺乳動物中的在C端結構上存在很大差異的抗菌肽，因其分子中都含有與cathelin(一種從豬白細胞中分離出的組織蛋白酶L抑制劑)相似的結構而得名[17]。（6）陰離子抗菌肽存在于牛支氣管及細支氣管的上皮細胞中。新生牛支氣管肺泡洗液中陰離子抗菌肽的濃度是成年牛的3倍，但對溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)的殺菌活性明顯弱于成年牛的[18]。陰離子抗菌肽的作用機制尚不清楚，但發現鋅能使其活性增加，因此推測陽離子鹽橋能克服微生物表面的負電荷。（7）牛乳鐵素(LfcinB)是乳鐵蛋白(LF)白在消化道正常生理條件下，在胃蛋白酶的作用下釋放出的一種肽，含25個氨基酸殘基，對應于LF氨基端的第17~41位氨基酸，牛乳鐵素的一級結構為：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCV RRAF。Lf-cinB的抑菌效果是LF的400倍，在胃腸道作用更強，耐熱，在消化道中不易降解，無抗原性。LfcinB可抗多種革蘭氏陽性和陰性菌，對耐抗生素的也有抑制作用[19]，還能抗病毒和真菌，但不作用于雙歧桿菌(Bacillus bifidus)等益生菌，能刺激細胞生長，參與免疫調節。

2　應用前景

2.1藥用開發領域由于抗生素的普遍使用，耐藥菌株的廣泛產生以及抗生素使用中在生物體內的殘留問題，日益引起人們的擔心和極大關注，因此，開發不易耐藥的、能夠替代抗生素的天然物質尤其必要也十分緊迫[20]。由于抗菌肽具有廣譜殺菌作用、相對分子量較小、熱穩定、水溶性好等優點，更為重要的是抗菌肽對真核細胞幾乎沒有作用，僅作用于原核細胞和發生病變的真核細胞，由于抗菌肽是生物體內自然產生的，對生物體本身不產生副作用。隨著分子生物學技術的發展，研究人員通過基因工程技術 對生物內抗菌肽進行研究，將抗菌肽基因克隆與表達，從而達到大批量生產，在醫藥領域廣抗菌肽逐步取代抗生素將成為可能。

2.2畜牧業領域在畜牧養殖業中，由于在抗生素大量使用，細菌的耐藥性已成為對養殖業危害最大，最棘手的問題之一。由于細菌的耐藥性，許多新藥以越來越快的速度被開發出來。但實踐表明，新藥的開發速度遠遠低于細菌產生抗藥性的速度，因而這幾年養殖業出現的現象就是新藥使用越來越多，而細菌耐藥性的產生也越來越快[21]。抗生素在動物組織中的殘留不僅影響了動物性制品的出口創匯，更嚴重的是可能影響人們的健康[22]。因此應用無毒、無殘留的藥物是當今養殖業急需解決的問題。鑒于此抗菌肽為合適的抗生素替代藥物之一，抗菌肽作為動物免疫防衛系統產生的一類活性小肽，由于其具有廣譜抗菌活性、低抗原性，對正常動物體細胞無損害，以及抗腫瘤、抗病毒抗真菌、抗寄生蟲等活性特點，倍受關注[23]。因此有可能成為替代抗生素的藥物或添加劑在養殖業得到廣泛的應用。

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收稿日期：（2015–12–08）

*通訊作者

基金項目：山東科技發展計劃項目(2013GNC11032)，濟南市科技計劃項目(201401268)

中圖分類號：S859.79+7

文獻標識碼：A

文章編號：1007-1733(2016)02-0056-03