FAM150B甲基化致低表達與鼻咽癌氣虛癌變研究*

周小軍，汪 蕓，張麗娟，林葆睿

(1．廣州中醫藥大學附屬中山醫院耳鼻咽喉科，廣東中山 528401; 2．廣州中醫藥大學附屬中山醫院病理科，廣東中山 528401)

FAM150B甲基化致低表達與鼻咽癌氣虛癌變研究*

周小軍1，汪 蕓2，張麗娟1，林葆睿1

(1．廣州中醫藥大學附屬中山醫院耳鼻咽喉科，廣東中山 528401; 2．廣州中醫藥大學附屬中山醫院病理科，廣東中山 528401)

目的:采用甲基化芯片及免疫組化研究FAM150B甲基化及其蛋白的表達。方法:3例鼻咽癌發病前后配對患者，采用甲基化芯片技術檢測FAM150B甲基化，隨機選擇100例患者，包括鼻咽癌和鼻咽炎各50例及氣虛質44例和正常質56例。采用免疫組化方法檢測FAM150B蛋白的表達。結果:FAM150B在鼻咽癌為高甲基化，FAM150B蛋白在鼻咽炎為高表達，在鼻咽癌為低表達，其表達值分別為(0.995±0.511，0.257±0.392);FAM150B蛋白在正常質為高表達，在氣虛質為低表達，其表達值分別為(0.765±0.615，0.449±0.498)。結論:FAM150B甲基化致其低表達為鼻咽癌及氣虛質的特征，FAM150B為鼻咽癌氣虛癌變的分子指標。

鼻咽癌;FAM150B;氣虛;甲基化

鼻咽癌為好發于廣東的具有明顯地域性及家族聚集性特點的惡性腫瘤。中醫腫瘤學認為，“正氣虛則成巖”(《外證醫案匯編·乳巖附論》)，臨床亦發現氣虛為鼻咽癌易感體質且貫穿于鼻咽癌發生的始終［1］。那么氣虛如何導致鼻咽癌癌變?其氣虛癌變的分子基礎是什么?早期研究［2］發現，在鼻咽癌發生癌變后，FAM150B基因發生了明顯的高甲基化改變。但是FAM150B基因高甲基化與鼻咽癌變以及與氣虛質的關系如何有待于進一步研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 病例標本

病例標本來源于廣州中醫藥大學附屬中山醫院門診病例。甲基化芯片標本:3例鼻咽癌發病前(鼻咽炎)、發病后(鼻咽非角化性癌)配對標本，2男1女，年齡分別為60歲、54歲、50歲。免疫組化標本:于我院病理科保存的鼻咽疾病石蠟組織塊中按中醫體質分層隨機抽出鼻咽癌及鼻咽炎各50例，其中鼻咽癌男性31例，女性19例，平均年齡(46.6±12.9)歲，氣虛質25例，正常質25例;鼻咽炎男性26例，女性24例，平均年齡(35.3±10.7)歲，氣虛質19例，正常質31例。

1.2 主要試劑及儀器

Roche-NimbleGen CpG promoter芯片(美國)，芯片覆蓋所有UCSC注釋的CpG島和所有RefSeq數據庫基因的啟動子區(產品目錄號00892)，探針覆蓋轉錄起始位點上游800 bp至下游200 bp以及28226個CpG島。

FAM150B兔抗人單克隆抗體，北京四方柏生物技術有限公司產品(編號WA-0374R);即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒，福州邁新生物技術公司產品(編號KIT-5030);抗原熱修復試劑，北京博奧森生物技術有限公司產品(編號C-0017)。

1.3 方法

1.3.1 甲基化芯片技術檢測鼻咽癌發病前后甲基化特征 應用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取鼻咽組織DNA。用超聲將DNA打斷成200 bp-500 bp DNA片斷，再進行甲基化DNA免疫共沉淀。加熱變性后的單鏈DNA樣品分成2份，其中1份樣品加入5'-甲基化胞嘧啶核抗體即MeDIP，另1份不加即Input;用免疫磁珠法分離樣品中甲基化DNA片斷的抗體復合物，清冼樣品中非甲基化DNA片段，純化免疫共沉淀的DNA片段。使用Sigma WAG Kit對上述2份 DNA片斷進行擴增和熒光標記(MeDIP以Cy5標記，對照Input用Cy3標記)，再進行芯片雜交，標記后的MeDIP與Input樣品混合、變性，與甲基化微陣列芯片雜交。芯片上每個探針的Cy5/Cy3強度比例顯示出該區域的甲基化程度。最后采用高解析度芯片掃描儀檢測雜交信號，專業分析軟件對雜交結果進行數據提取、標準化和峰值分析。

1.3.2 免疫組化檢測方法 利用PBS代替一抗做空白對照，已知陽性切片做陽性對照。抗原修復采用酸性修復方法，枸櫞酸緩沖液(pH6.0)隔水煮沸(沸水浴約92～95℃)修復15 min，自然涼至室溫。山羊血清封閉，37℃孵育20 min。待測抗體孵育4℃過夜，再按免疫組化試劑盒說明書操作。

免疫組化判斷標準及計分方法:以細胞核或細胞質中出現淺黃至棕黃色顆粒作為陽性細胞。在光學顯微鏡400倍視野下，每張切片隨機選取5個視野，辨別陽性細胞和陰性細胞，并計算每個視野的陽性表達率。計算方法［3］:計數5個高倍視野中陽性細胞和陰性細胞總數。陽性表達率=陽性細胞數/ (陽性細胞數+陰性細胞數)×100%。同時，對每張切片的陽性表達染色強度進行評分:無染色為0分，淺黃色1分，深黃色2分，黃褐色為3分。陽性表達值=陽性表達率×染色強度分值。

1.3.3 中醫體質診斷 氣虛質以長期疲倦感、易汗出、舌淡紅、脈弱等為主要特征，正常質氣血陰陽平和之人，無寒熱偏向及虛弱表現。體質分類標準參見文獻［1］。

1.3.4 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，以其陽性表達值進行統計分析，氣虛質鼻咽癌及氣虛質鼻咽炎FAM150B比較采用t檢驗。氣虛質與正常質FAM150B比較，將疾病(鼻咽炎、鼻咽癌)作為協變量，鼻咽癌與鼻咽炎FAM150B的比較，將氣虛質作為協變量，采用協方差分析的方法進行統計，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌發病前后CpG島及啟動子區甲基化情況

3例鼻咽癌患者從發病前到發病后CpG島發生了明顯的甲基化，甲基化峰分別從癌變前1086個、2359個、2810個上升到癌變后的2708個、3510個、3246個。且甲基化主要集中在啟動子區，啟動子區甲基化峰分別從癌變前231個、1134個、820個上升到癌變后的1336個、1769個、1626個。

FAM150B基因的啟動子區 CpG島(chr2: 277353-280099)，在3例鼻咽癌發病前均未出現甲基化，而在鼻咽癌發生癌變后均出現甲基化峰。

2.2 鼻咽癌與鼻咽炎、氣虛質與正常質FAM150B的表達

表1圖1顯示，FAM150B蛋白主要在細胞漿表達，細胞核亦有表達;陽性表達為黃色，依表達強度不同可分別顯現為淺黃色、深黃色或黃褐色。FAM150B蛋白在鼻咽炎為高表達(陽性范圍廣且陽性程度深)，而在鼻咽癌為低表達甚至不表達，按中醫體質分組，FAM150B蛋白在正常質為高表達，而在氣虛質為低表達。

表1 鼻咽癌與鼻咽炎、氣虛質與正常質FAM150B的表達(±s)

表1 鼻咽癌與鼻咽炎、氣虛質與正常質FAM150B的表達(±s)

注:與鼻咽炎比較:*F=63.166，P＜0.01;與正常質比較:△F= 6.523，P＜0.05

組 別 例數FAM150B鼻咽癌 50 0.257±0.392*鼻咽炎 50 0.995±0.511氣虛質 44 0.449±0.498△正常質56 0.765±0.615

2.3 氣虛質鼻咽癌、正常質鼻咽癌、氣虛質鼻咽炎、正常質鼻咽炎FAM150B的表達

FAM150B在鼻咽癌及氣虛質均表現為低表達，表2顯示，FAM150B依氣虛質鼻咽癌、正常質鼻咽癌、氣虛質鼻咽炎、正常質鼻咽炎次序逐漸升高(F =25.316，P＜0.01);兩兩比較顯示，除外氣虛質鼻咽癌與正常質鼻咽癌比較差異無統計學意義(P ＞0.05)，其余比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

表2 氣虛質鼻咽癌、正常質鼻咽癌、氣虛質鼻咽炎、正常質鼻咽炎FAM150B的表達(±s)

表2 氣虛質鼻咽癌、正常質鼻咽癌、氣虛質鼻咽炎、正常質鼻咽炎FAM150B的表達(±s)

注:與氣虛質鼻咽癌比較:＊＊P＜0.01;與正常質鼻咽癌比較:△△P＜0.01;與氣虛質鼻咽炎比較:※P＜0.05

組別 例數FAM150B氣虛質鼻咽癌25 0.176±0.334正常質鼻咽癌 25 0.339±0.434氣虛質鼻咽炎 19 0.808±0.451＊＊△△正常質鼻咽炎 31 1.109±0.518＊＊△△※

圖1 FAM150B在氣虛質及正常質鼻咽炎及鼻咽癌上皮中的表達(免疫組化染色 ×400)

3 討論

表觀遺傳學主要研究在沒有DNA序列改變情況下，基因功能可逆和可遺傳的改變其重要內容之一為甲基化，啟動子區CpG島的異常高甲基化是抑癌基因失活的重要機制，DNA甲基化成為目前腫瘤研究的熱點［4］。中醫體質學說認為，體質是在先天遺傳基礎上經后天飲食環境共同作用形成的，表觀遺傳中的DNA序列不變而功能可變的特性與中醫體質學說具有極大的相似性，因而從甲基化角度從事中醫研究成為當前熱點研究內容。

運用高通量甲基化芯片技術篩選出在鼻咽癌發病前后出現了特異性高甲基化的FAM150B基因，再通過病例對照研究FAM150B蛋白在氣虛質及鼻咽癌的表達情況，結果顯示在鼻咽癌癌變后FAM150B基因出現了明顯的甲基化且其蛋白為低表達或不表達，故認為FAM150B基因高甲基化致其低表達為鼻咽癌癌變特征，推測FAM150B可能為鼻咽癌的抑癌基因。同時發現，FAM150B在氣虛質為低表達(相比于正常質)且依氣虛質鼻咽癌、正常質鼻咽癌、氣虛質鼻咽炎、正常質鼻咽炎次序表達逐漸升高，故認為FAM150B基因高甲基化致其蛋白的低表達為鼻咽癌氣虛癌變的特征。

FAM150B(family with sequence similarity 150，member B)，Gene ID:285016，染色體定位于2p25.3。為序列相似性家族成員之一，序列相似性家族成員可廣泛分布于機體的各個組織，其功能可能與細胞信號傳遞、細胞的增殖分化、成熟與凋亡有關，這個家族中成員在癌癥發病過程中起重要作用。有研究表明［5］，在細胞體外惡性轉化過程中，此家族成員染毒前呈非甲基化狀態，而在轉化前和轉化后呈甲基化狀態，可能成為化學毒物暴露監測及腫瘤預測的生物標志物。該研究結果與本研究結果相類似。

鼻咽癌氣虛致癌是一個重要命題，相關專家［6］也作了有益的探索，發現氣虛質鼻咽癌存在著特定的蛋白表達差異，這肯定了研究方向。但因氣虛是一種亞健康態，與很多疾病有關，氣虛致癌與否以及如何致癌一直難以具體說明。本課題組的研究思路是先確定與鼻咽癌發病有關的致癌蛋白，再研究其是否在氣虛質中存在表達差異，最后篩選確認FAM150B為鼻咽癌氣虛致癌標志蛋白。

高甲基化致其低表達可能是抑癌基因參與癌變的重要方式，如抑癌基因FHIT在乳腺癌、肺癌、胃腺癌等多種腫瘤的發生過程中都發生了甲基化而呈現低表達，而這種生理病理過程與中醫證型有關。FHIT基因在陽虛組的甲基化表達有增加的趨勢［7］，與本研究結果相類似。FAM150B致鼻咽癌氣虛癌變是否有代表性和普遍性，有待于進一步的研究和證實。

［1］周小軍，田道法．鼻咽癌家系成員體質調查研究［J］．中國中醫基礎醫學雜志，2002，8(11):860-863．

［2］周小軍，陳江華，王士貞，等．鼻咽癌癌變前后 ADAM23、MIMT1、FAM150B、GRIN2A、LRRC4甲基化研究［J］．重慶醫科大學學報，2014，39(3):341-344．

［3］汪蕓，王書芹，周小軍，等．CyclinD1和Skp-2在鼻咽癌及癌前病變中的表達及其病理意義研究［J］．中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志，2013，21(3):171-173．

［4］Esteller M，Corn PG，Baylin SB，et al．A gene hypermethylation profile of human cancer［J］．Cancer Res，2001，61:3225-3229．

［5］曾君玲，張波，楊萍，等．細胞體外惡性轉化過程中差異甲基化基因的篩選［J］．中華預防醫學雜志，2011，45(5):404-409．

［6］陳舒華，田道法，張繼平，等．鼻咽癌高癌家系癌患者不同體質證型的蛋白質組學研究［J］．中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志，2013，21(1):5-9．

［7］曾躍琴，李煒弘，張天娥，等．腎陽虛證免疫相關基因CPG島調控機制研究［J］．時珍國醫國藥，2013，24(6):1515-1517．

Research of FAM150B Methylation leads to its Low Expression and Qi Deficiency Related to Nasopharyngeal Carcinoma

ZHOU Xiao-jun1，WANG Yun2，ZHANG Li-juan1，LIN Bao-rui1
(1．Department of Otorhinolaryngology，Affiliated Zhongshan Hospital of Guangzhou University of TCM，Zhongshan，Guangdong 528401，China;2．Department of Pathology，Affiliated Zhongshan Hospital of Guangzhou University of TCM，Zhongshan，Guangdong 528401，China)

Objective:FAM150B methylation and its expression in nasopharyngeal carcinoma and the qi deficiency were studied by methylation chip technology and immunohistochemical method．Method:3 patients with nasopharyngeal carcinoma before and after the onset of matching，using methylation chip technology to detect FAM150B methylation，100 patients by randomly selected，including 50 cases of nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngitis，including qi deficiency of 44 cases and normal 56 cases，using immunohistochemical method to detect FAM150B protein expression．Results: FAM150B for high methylation in nasopharyngeal carcinoma，FAM150B protein for high expression in nasopharyngitis，for lower expression in nasopharyngeal carcinoma，the expression values were 0.995±0.511 and 0.257±0.392 respectively．FAM150B protein expressed in normal quality is high，the qi deficiency of quality for lower expression，the expression values were 0.765±0.615 and 0.449±0.498 respectively．Conclusion:FAM150B methylation to its lower expression in nasopharyngeal carcinoma and the qi deficiency of qualitative characteristics，FAM150B may be molecular indicator of qi deficiency for nasopharyngeal cancer．

Nasopharyngeal Carcinoma;FAM150B;Qi Deficiency; Methylation

R739．63

B

1006-3250(2016)01-0096-03

2015-04-11

國家自然科學基金資助項目(81072847，81373698)

周小軍，男，教授，博士研究生導師，從事鼻咽癌中西醫結合臨床與研究。