芪葉保肝飲對肝癌細胞增殖和凋亡作用的研究*

牛春紅，田新強，朱壯彥

(大同大學，山西大同 037009)

芪葉保肝飲對肝癌細胞增殖和凋亡作用的研究*

牛春紅，田新強，朱壯彥

(大同大學，山西大同 037009)

目的:研究芪葉保肝飲(SLPLD)對肝癌細胞增殖和凋亡的作用。方法:研究SLPLD清除DPPH自由基的能力和抗氧化作用;研究不同劑量SLPLD對HepG2細胞增殖與凋亡的作用;建立小鼠腫瘤模型，實驗組灌胃SLPLD，至第30天時結束描繪移植瘤生長曲線、稱量終末移植瘤質量并計算抑瘤率。結果:SLPLD清除DPPH自由基能力隨劑量增加而升高，呈線性相關:R2= 0.9947，IC50=15.74ul;SLPLD對HepG2細胞增殖結果顯示細胞數量隨SLP著LD劑量增加而減少。流式結果顯示隨SLPLD使用劑量增加，HepG2細胞凋亡率由9.23%逐漸增加到42.9%;小鼠腫瘤模型第30天時SLPLD實驗組腫瘤體積與平均腫瘤重顯著小于對照組，腫瘤抑制率為40.3%。結論:SLPLD這一新型中成藥具有較強的抗氧化活性，能夠抑制HepG2肝癌細胞增長，促進其凋亡。

芪葉保肝飲;HepG2;抗氧化活性;細胞增殖;細胞凋亡

我國每年因肝癌死亡者高達60萬人，達全球肝癌患者總數的50%以上，且發病率呈現一定上升勢態。當前臨床通常采用手術以及放療和化療的方式治療肝癌，對抑制腫瘤細胞的增生起到一定的效果，但往往伴隨較大的毒副作用。近年來，中醫藥治療肝癌逐步得到認可，中藥可以提高機體的抗氧化作用，誘導腫瘤細胞的凋亡，達到防癌治癌的目的［1］。同時中藥性質比較溫和，對患者身體的損傷較小，具有較強的臨床應用和推廣價值。

芪葉保肝飲(SLPLD)為治療肝癌的中成藥，主要成分來源于正北芪(恒山黃芪)、松葉、橘葉、竹葉、枸杞和蘆根等中藥，其中黃芪是生產SLPLD的主要原料。黃芪、枸杞補中益氣，具有增強免疫系統功能、保肝、抗腫瘤、清除自由基和抗衰老等作用［2-4］。有研究表明，竹葉黃酮是一種極具開發潛力的天然抗氧化劑［5］。本文通過研究 SLPLD對HepG2肝癌細胞凋亡的作用，初步研究其對小鼠腫瘤生長的影響，為SLPLD抗腫瘤提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

BALB/C雄性裸鼠50只，體質量20 g～26 g，購于中科院北京實驗動物中心(許可證編號SCXK京2011-0004)，在山西醫科大學動物實驗中心清潔喂養。

1.2 材料及試劑

SLPLD為中成藥，成分包括正北芪(恒山黃芪)、松葉、橘葉、竹葉、枸杞和蘆根。人肝癌細胞株HepG2(本實驗室保存)，二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)(美國Sigma公司，批號 S43654-098)，Cell Proliferation Reagent WST-1試劑盒、nuclear/cytosolfractionation kit、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發光液(美國pierce公司)。

1.3 SLPLD清除DPPH自由基的作用

用PBS將SLPLD稀釋成不同濃度，分別取15 μL原液稀釋2倍、4倍樣品和60 μL 17 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)以及150 μL 1 mmol/L DPPH溶液混合，避光反應30 min。同時用水溶性維生素 E (Trolox)作為陽性對照［3］，乙醇溶液作為顏色空白對照，PBS作為空白對照。均取波長520 nm下的反應液吸光值，最后按下述公式計算:自由基清除率=［OD520(空白對照)－(OD520(樣品)－OD520 (顏色對照)/OD520(空白對照)］×100%。得到樣品的自由基清除率，在相同DPPH自由基清除率下的樣品濃度對應 Trolox濃度，為此濃度樣品的Trolox當量濃度。

通過回歸分析得出多糖濃度與清除率之間的回歸方程，根據方程計算出其IC50(清除率為50%時的濃度)，每組實驗重復3次。

1.4 SLPLD對HepG2細胞增殖及凋亡的影響

1.4.1 HepG2細胞培養 人肝癌細胞株HepG2(本實驗室保存)細胞復蘇后，于12%胎牛血清的DMEM培養基中培養，含1%的青鏈霉素(100 IU/ml青霉素和100 ng/ml鏈霉素)以及2 mM的谷氨酸，于37℃、5%CO2條件下培養。換液周期為1～2 d，3～4 d傳代1次。

1.4.2 SLPLD對HepG2細胞增殖的影響 用Cell Proliferation Reagent WST-1(Roche，USA)試劑盒檢測HepG2細胞在SLPLD作用下的活力和增殖情況。在96孔板中加入2×104個/孔HepG2細胞，37℃、5%CO2條件下培養12 h后，分別加入5 μL、10 μL、15 μL和20 μL SLPLD處理細胞，對照組分別加入與之相同劑量的PBS(空白對照)和板藍根溶液(板藍根注射液，山西太原藥業有限公司，陰性對照)孵育18 h。棄上清培養基，PBS洗滌3次，加入20 μL WST-1試劑和180 μL培養基孵育1 h，分別讀取各組在450 nm處的吸光值。

1.4.3 流式細胞儀檢測SLPLD對HepG2細胞凋亡的作用 ①在6孔板中，每孔加入2×105個/孔HepG2細胞，37℃、5%CO2條件下培養12 h，0 μL、25 μL、50 μL、75 μL、100 μL SLPLD處理16 h，胰酶消化，含12%胎牛血清的培養基終止反應，1000 rpm、8 min離心收集細胞。PBS洗滌3次，1000 rpm、8 min離心收集細胞;②加入500 ul的Binding Buffer懸浮細胞，然后加入5 ul Armexin VAPC溶液混勻，室溫避光反應15 min;③加入5 ul 7-AAD染液混勻，室溫避光反應15 min;④1 h內用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=633 nm，最大發射波長Em=660 nm，Annexin V-APC的紅色熒光使用FL4通道檢測，激發波長Ex=546 nm，發射波長Em =647 nm，7-AAD紅色熒光使用FL3通道檢測。Em =647 nm，7-AAD紅色熒光使用FL3通道檢測。

1.5 SLPLD對小鼠腫瘤生長的影響

1.5.1 小鼠腫瘤模型的建立 取對數生長期的HepG2細胞，胰酶消化后重懸于PBS中，調整細胞濃度至6.0×106個/ml。每只裸鼠背部皮下注射細胞懸液200 μL，所有實驗小鼠均在恒溫(25± 1)℃、恒濕(50%±10%)、無特定病原體(SPF)條件下的層流架中飼養，自由飲食。移植腫瘤細胞10 d左右，挑選背部移植的腫瘤大小生長至100 mm3～200 mm3的小鼠20只用于試驗。

1.5.2 實驗分組 將實驗小鼠按隨機數字表法分為實驗組和對照組2組各10只，實驗組灌胃SLPLD 200 μL/只，每天早晚各1次，對照組灌胃同等劑量的生理鹽水。

1.5.3 SLPLD對小鼠腫瘤的影響 從首次給藥開始，用游標卡尺每天測量記錄各組腫瘤體積，用游標卡尺測量腫瘤結節的長度和寬度(精確到0.002 cm)，按公式V=ab2/2計算腫瘤的體積［6］，至第30天時結束實驗。在第30天時麻醉并處死裸鼠，手術剝離切除腫瘤組織稱重，并用如下公式計算抑瘤率［7］:腫瘤抑制率(%)=［1－(實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重)］×100%。

1.6 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLPLD的抗氧化作用

表1顯示，SLPLD清除DPPH自由基的能力隨劑量增加而升高且呈線性相關。它們之間的線性回歸方程為:y=0.029x+0.0434，R2=0.9947，IC50 =15.74 ul。隨著自由基清除率的增加，相對Trolox的當量濃度也隨之增大。

表1 SLPLD對DPPH自由基的清除作用(±s)

表1 SLPLD對DPPH自由基的清除作用(±s)

SLPLD劑量(μL) 清除率(%) Trolox當量濃度(μg/ml) 3.75 12.3±1.9 24.7± 1.6 7.50 28.2±3.1 41.3± 1.7 15．00 49.9±7.5 75.7± 9.2 30．00 90.3±8.7 180.6±16.8

2.2 SLPLD對HepG2細胞增殖及凋亡影響

2.2.1 SLPLD對HepG2細胞的增殖作用 圖1顯示，不同劑量板藍根和PBS處理下的HepG2細胞數量比較差異無統計學意義，SLPLD實驗組細胞數量隨著劑量增加而減少。15 ul和20 ul的SLPLD實驗組HepG2細胞數量顯著少于板藍根組和PBS組(P＜0.05)。

2.2.2 流式細胞儀檢測SLPLD對HepG2細胞凋亡的作用 圖2顯示，X軸表示APC染色熒光，Y軸表示7-AAD染色熒光;A區表示壞死細胞，表現為APC-/7一AAD+;B區表示晚期凋亡細胞，表現為ApC+/7-AAD+;C區表示正常細胞，表現為APC一/7～AAD-;D區表示早期凋亡細胞，表現為APC+/7-AAD-。隨著SLPLD劑量的增加，晚期凋亡細胞比例逐漸增加，由9.23%增加到42.9%。

2.3 SLPLD對小鼠腫瘤生長的作用

圖1 SLPLD對HepG2細胞增殖的作用

圖3、4顯示，SLPLD實驗組與對照組隨著時間增加，腫瘤體積均逐漸增大。第30天時，SLPLD實驗組腫瘤體積(7.52±3.63)mm3顯著小于對照組(11.07±4.12)mm3(P＜0.05)。稱量對照組平均腫瘤質量為(4.57±0.82)g，SLPLD實驗組平均腫瘤質量為(2.73±0.82)g，實驗組質量小于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，腫瘤抑制率為40.3%。

3 討論

早在上世紀80年代，人們就發現自由基與癌癥的發生密切相關。自由基通過作用于 DNA導致機體遺傳物質發生改變，引起蛋白質結構、功能變化，肽鍵斷裂、非正常聚合以及脂質過氧化等，最終可能導致腫瘤的發生［8］。研究發現，采用抗氧化劑干預、阻斷自由基的形成，可以預防腫瘤發生［9-10］。本研究顯示，SLPLD具有較強的清除自由基的能力。

圖2 流式細胞儀檢測SLPLD對HepG2細胞凋亡的作用

圖3 SLPLD對小鼠腫瘤生長的作用

圖4 SLPLD對小鼠腫瘤生長作用變化曲線

宋巖［11］等研究表明，黃芪可顯著抑制HepG2細胞增殖，細胞凋亡率隨黃芪濃度增加而逐漸升高，存在劑量依賴性。耿國軍［12］等研究黃芪對肺腺癌細胞生長的影響，表明不同濃度的黃芪處理后細胞生長受到明顯抑制，細胞生長抑制率隨黃芪的濃度增加而增長。本研究結果表明，SLPLD能抑制HepG2細胞的增殖。流式細胞儀檢測結果顯示，隨著SLPLD的劑量增加，晚期凋亡細胞比例呈逐漸增加趨勢，說明SLPLD具有致HepG2細胞凋亡的作用。

谷俊朝［13］等通過研究黃芪多糖對TA2小鼠乳腺癌MA-891移植瘤生長發現，服用黃芪多糖的小鼠瘤質量有所減輕，具有一定的抑瘤作用。劉成軍［14］等研究黃芪注射液對人鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤的抑制作用，結果顯示黃芪注射液高、中劑量組移植瘤體積明顯低于對照組，瘤質量明顯低于對照組，抑瘤率分別為39.90%、30.77%。任美萍［15］等研究表明，黃芪多糖在50、100 mg/kg時，對H22的抑瘤率分別為32.84%、45.09%，對S180的抑瘤率分別為36.55%、50.35%。本研究通過在小鼠皮下注射HepG2細胞建立相應的腫瘤模型，給裸鼠灌胃適量的SLPLD治療并觀察腫瘤生長變化情況，通過測量腫瘤體積以及質量評估SLPLD的治療效果，結果表明SLPLD對腫瘤的生長有一定的抑制作用。

綜上所述，SLPLD這一新型中成藥具有較強的抗氧化活性，能夠抑制HepG2肝癌的生長，促進肝癌細胞凋亡，并對抑制腫瘤的生長有一定作用，值得臨床推廣應用。

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Study of Qiye Baogan Decoction on Proliferation and Apoptosis of Hepatocellular Carcinoma Cells

NIU Chun-hong，TIAN Xin-qiang，ZHU Zhuang-yan△
(Datong University，Datong，Shanxi 037009，China)

Objective:To study the role of Qi Ye Bao Gan Yin(SLPLD)in liver cancer cell proliferation and apoptosis．Method:Study the SLPLD’s ability of DPPH scavenging and its antioxidant effect．Research the Effect of different doses SLPLD on appreciation of HepG2 cells．Established the tumor model in mice．The experimental group was given SLPLD．Experiment were ended at the 30thday．Depict the tumor growth curve，weighing the terminal tumor mass，and inhibition rate was calculated．Result:DPPH scavenging ability positively correlated with the dose of SLPLD，and showed．linear correlation R2=0.9947，IC50=15.74ul．SLPLD’s effect on HepG2 cell proliferation and apoptosis showed that in SLPLD experimental group，cell number and the doses of SLPLD were negatively correlated．In SLPLD group with SLPLD dose increase，HepG2 cell apoptosis rate increasing from 9.23%to 42.9%gradually．③At the 30th day，SLPLD tumor volume in experimental group was significantly smaller than the control group．Tumor inhibition rate was 40.3%．Conclusion:The new medicine SLPLD shows a strong antioxidant activity，it can inhibit the growth of HepG2 and promote its apoptosis．

SLPLD;HepG2;Antioxidant activity;Cell proliferation;Apoptosis

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0059-03

2015-05-09

山西省科技廳科技攻關項目-糖尿病、呼吸系統、消化系統疾病發病機制、并發癥及影響因素的研究-芪葉保肝飲對酒精性肝病的臨床應用研究(20130313017-1)

牛春紅(1973-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，副教授，醫學碩士，從事肝病的臨床與研究。