大瓣鐵線蓮的粗提物體外抗癌活性研究△

蘇　琨　代金華　白小榮（.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院　包頭04040；.內(nèi)蒙古集寧師范學(xué)院數(shù)學(xué)系　集寧　0000）

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大瓣鐵線蓮的粗提物體外抗癌活性研究△

蘇琨1代金華2白小榮1（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院包頭014040；2.內(nèi)蒙古集寧師范學(xué)院數(shù)學(xué)系集寧012000）

摘要：目的：研究大瓣鐵線蓮的四種粗提物體外抗癌活性。方法：針對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2，采用MTT比色法，檢測(cè)4種不同溶劑的粗提物做體外抗癌活性研究，計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率和IC50。結(jié)果：除乙酸乙酯粗提物外，石油醚、水、正丁醇粗提物的吸光度A與陰性對(duì)照組比較有顯著差異，劑量和藥效存在一定相關(guān)性。結(jié)論；蒙藥大瓣鐵線蓮石油醚、水、正丁醇粗提物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2有一定抑制作用，有必要對(duì)其活性成分進(jìn)行篩選和分離。

關(guān)鍵詞：大瓣鐵線蓮粗提物MTT比色法體外抗癌活性

大瓣鐵線蓮，毛茛科鐵線蓮屬，學(xué)名Clematismacropetala Ledeb．主要分布于東北、西北、河北、山西等地區(qū)，生于山地林下、林緣草甸[1]。大瓣鐵線蓮的藥材基原為大瓣鐵線蓮的地上部分，收載于《中華本草》（蒙藥卷）、《中華醫(yī)學(xué)百科全書》（蒙醫(yī)分卷）、《無(wú)誤蒙藥鑒》和《內(nèi)蒙古植物藥志》等著作，主治肝熱、肺熱、腸刺痛、熱瀉，有理胃火、助消化、祛解痞的功效。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，大瓣鐵線蓮的藥理研究鮮有報(bào)道。利用MTT比色法對(duì)大瓣鐵線蓮的四種粗提物體外抗癌活性篩選，為大瓣鐵線蓮的合理應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，豐富民族醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的科學(xué)內(nèi)涵。

1　儀器與材料

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本SANYO SHEL LAB；酶標(biāo)儀，Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀。

人肝癌細(xì)胞株HepG2引自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四季青胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司。PBS，DMSO和青鏈霉素均購(gòu)自?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司。噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；去離子水，正丁醇、乙酸乙酯、石油醚均為分析純。

大瓣鐵線蓮藥材為2014年7月采于包頭市九峰山，經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院教授李旻輝鑒定為毛茛科鐵線蓮屬大瓣鐵線蓮（Clematis macropetala Ledeb.）

2　方法

2.1粗提物的提?。捍蟀觇F線蓮地上部分自然陰干后，取其15倍質(zhì)量的工業(yè)酒精回流提取4次，每次3h。合并提取液并回收溶劑至膏狀。浸膏依次用8倍質(zhì)量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取3次，合并相同提取液并回收溶劑，得4種溶劑的粗提物P（石油醚粗提物）、E（乙酸乙酯粗提物）、B（正丁醇粗提物）、W（水粗提物），置于低溫冰箱保存。使用前用杜爾伯科改良伊格爾高糖培養(yǎng)基（即DMEM高糖培養(yǎng)基）稀釋到所需濃度。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)：在5%CO2、37℃條件下，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，2d傳代或換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3體外抗肝癌活性成分篩選：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×104mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。培養(yǎng)過(guò)夜后，陰性對(duì)照組加入100μL培養(yǎng)基，給藥組分別加入終濃度為0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg·mL-1鐵線蓮粗提物；陽(yáng)性對(duì)照組加入不同濃度的順鉑（0.001、0.005、0.01、0.02、0.03mg·mL-1），另設(shè)調(diào)零組（不加細(xì)胞及藥物），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，棄去含藥培養(yǎng)基，每孔加入100μL無(wú)血清培養(yǎng)基及20μLMTT （5mg·mL-1）。在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)4h后，吸去培養(yǎng)基和MTT，每孔加入150μLDMSO，在低速搖床上震蕩10min，在酶標(biāo)儀上492nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組吸光度（A值）。

3　結(jié)果

3.14種粗提物的吸光度A值測(cè)定：在5種不同濃度下測(cè)定吸光度A，結(jié)果見(jiàn)表1。表中的數(shù)據(jù)均為減去空白的吸光度A，每組數(shù)據(jù)測(cè)定5次，用平均值±SD表示。

表1　不同溶劑、不同濃度粗提物的吸光度A

3.2不同濃度粗提物的HepG2腫瘤細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算：根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率:細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-加藥孔平均A 值/陰性對(duì)照孔平均A值）×100%。A值為每組各復(fù)孔的均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　不同濃度粗提物的HepG2腫瘤細(xì)胞增殖抑制率

3.3劑量和藥效關(guān)系：以抑制率為Y軸，濃度為X軸，作劑量和藥效曲線圖，見(jiàn)圖1。

3.4不同溶劑的粗提物的IC50：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用logit模式進(jìn)行probit分析并計(jì)算IC50。

表3　四種粗提物的IC50

4　結(jié)論與討論

關(guān)于半數(shù)抑制濃度IC50的計(jì)算方法有很多，如線性回歸法[2]，或者利用SAS、Origin等專業(yè)軟件繪制曲線方程后，再計(jì)算出IC50[3～6]。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，抑制率和藥物濃度不是嚴(yán)格的線性關(guān)系，用線性回歸計(jì)算得到的IC50存在較大誤差。本實(shí)驗(yàn)利用SPSS軟件，錄入濃度、抑制率、總值（數(shù)值=1）三組相關(guān)數(shù)據(jù)，采用logit模式進(jìn)行probit分析，由軟件計(jì)算得到IC50值（概率為0.50對(duì)應(yīng)的濃度值）。該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的契合度高，分析結(jié)果更準(zhǔn)確。

除乙酸乙酯粗提物外，石油醚粗提物P、正丁醇粗提物B和水粗提物W的IC50依次為0.797、0.543、1.031mg·mL-1。雖然三者的IC50均大于陽(yáng)性組（陽(yáng)性組順鉑的IC50為0.04mg·mL-1），但劑量和藥效關(guān)系都具有明顯正相關(guān)性，說(shuō)明三種提取物存在一定的抗癌活性。在今后對(duì)大瓣鐵線蓮抗癌作用深入研究時(shí)，可以優(yōu)先選擇正丁醇作為溶劑，提取、分離出抗癌活性更高的單體化合物。

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基金項(xiàng)目：△內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZY13250）。

中圖分類號(hào)：R927.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）01-0099-02