腹水型抗EGF R單克隆抗體純化方法的研究△

蔡洪敏　王業勝　許國鳳　李黃金　趙　林（廣東藥學院生命科學與生物制藥學院　廣州510006）

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腹水型抗EGF R單克隆抗體純化方法的研究△

蔡洪敏王業勝許國鳳李黃金趙林*（廣東藥學院生命科學與生物制藥學院廣州510006）

摘要：目的：研究腹水型抗EGFR單克隆抗體的純化方法。方法：抗EGFR雜交瘤細胞誘生的腹水，經離心預處理，上清先用PEG6000沉淀，沉淀物溶解再用Protein-A柱親和純化，SDS-PAGE鑒定純化效果。結果：經兩步純化，抗EGFR單抗純度達到了98%以上，收率達到90%以上。結論：PEG6000沉淀和Protein-A柱親和層析相結合，是純化腹水型單抗體的一種高效方法。

關鍵詞：腹水EGFR單克隆抗體純化

表皮生長因子受體（epidermical growth factor receptor，簡稱為EGFR）是當前腫瘤治療的熱門靶點，采用單克隆抗體封閉EGFR信號通路，以抑制EGFR過表達或突變的腫瘤細胞的生長，是治療EGFR相關腫瘤的一種主要策略[1]。我們在前期研究中，發現了EGFR二聚化界面的一個腫瘤B細胞表位肽[2]，針對該表位制備了特異性的抗EGFR單克隆抗體。為詳細研究該單抗的功能，本文研究其純化方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑：抗EGFR小鼠腹水由本實驗室制備，-20℃凍存備用；PEG6000：上海翊圣生物公司；Protein-A親和層析預裝柱（5mL）：北京康為世紀公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒：北京鼎國昌盛公司；低分子量蛋白Marker：大連寶生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1腹水預處理：將-20℃凍存的抗EGFR腹水于4℃解凍過夜，4℃，10000×g離心15min，吸棄表層油脂，上清于4℃保存備用。

1.2.2采用PEG6000進行粗分離：取上清置于冰上，加入等體積預冷的20mM磷酸鹽緩沖液，攪拌均勻。邊攪拌邊緩慢加入預冷的濃度為30%的PEG6000溶液，至終濃度為10%。冰上放置1h后，8000rpm離心20min，棄上清，收集沉淀。沉淀用適量含300mM NaCl，pH8.0，20mM磷酸鹽緩沖液溶解成蛋白濃度約為1mg/mL的溶液。

1.2.3采用Protein-A柱進行精細純化：Protein-A柱用含300mM NaCl，pH8.0的20mM磷酸鹽緩沖液流洗5～10個柱床體積，以平衡柱子。將上一步溶解的樣品上柱，速度控制在2mL/min。以平衡緩沖液沖洗柱子5～10個柱床體積，至基線平穩。用pH4.0 的0.1M檸檬酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫峰樣品，用pH9.0的1M Tris-HCl中和緩沖液將洗脫峰樣品中和至中性。用5～10個柱床體積平衡緩沖液平衡柱子至中性。

1.2.4樣品濃度及純度測定：用BCA蛋白濃度測定試劑盒分別測定腹水、PEG6000粗分離產物、Protein-A柱精細純化產物的濃度，用SDS-PAGE分析各樣品中抗EGFR單抗的純度。

2　結果與分析

2.1純化結果：預處理后的腹水樣品經PEG6000沉淀后，單抗被選擇性沉淀下來，在上清中幾乎沒有殘留，同時白蛋白等主要雜蛋白被留在上清中，PEG6000很好地實現了粗分離，如圖1所示。經凝膠掃描軟件分析，粗分離后單抗的純度達到85%以上。粗分離的單抗經Protein-A柱純化后，洗脫峰樣品中幾乎無雜質，經凝膠掃描軟件分析，純度達到98%以上，如圖2所示。

2.2純化收率和純度：經凝膠掃描分析軟件分析，PEG6000粗分離樣品的純度達到85.6%，Protein-A柱精細純化后，抗體的樣品純度達到98%以上。PEG6000沉淀分離后，目標產物的收率達到91%，Protein-A柱親和層析后，收率達到89%，兩步純化的總收率達到80.99%，收率較高。

3　討論

單抗的純化是進行抗體功能研究的前一步。在目前的純化方法中，有鹽析法、親和純化法、透析法，純度往往達不到應用要求[3，4]。在本研究中，PEG6000具有很好的沉淀選擇性，10%的PEG6000很好地沉淀了單抗而將大量的主要雜蛋白即白蛋白留在上清中。這一步的純化為后一步Protein-A柱的親和層析，減輕了上樣負擔，增加了純化的效率。本研究的兩步純化法純化單抗，既有高的純度又有高的回收率，是純化單抗一種行之有效的方法。

參考文獻

[1]Roskoski RJ.The ErbB/HER family of protein-tyrosine kinases and cancer[J].Pharmacological Research.2013，79C：34-74.

[2]Zhu L，Zhao L，Wu M，Chen Z，Li H.B-cell epitope peptide vaccination targeting dimer interface of epidermal growth factor receptor（EGFR）[J].Immunol Lett.2013，153（1-2）：33-40.

[3]肖增鴻，黃昭亮，林月霞，等.腹水型單克隆抗體純化方法的研究[J].中國醫藥生物技術，2013，8（6）：425-428.

[4]周玉，李巖松，潘風光，等.小鼠腹水IgG類單克隆抗體純化方法的研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2006，10：14-16.

△項目來源：廣東藥學院大學生創新創業訓練計劃項目（1057313025）；廣東省科技計劃項目（2014A020210027）；廣東省自然科學基金項目（2015A030310120）。

*通訊作者

中圖分類號：R73

文獻標識碼：B

文章編號：1672-8351（2016）01-0098-01