分子生物學方法檢測沙門氏菌的研究進展

楊　柳,胡文忠,*,姜愛麗,馮　可,2,王　馨

(1.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

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分子生物學方法檢測沙門氏菌的研究進展

楊柳1,胡文忠1,*,姜愛麗1,馮可1,2,王馨1

(1.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

沙門氏菌是一種能引起人畜共患病的病原菌,由其引起的食物中毒事件屢居首位,在食品致病菌的檢測中,沙門氏菌的檢測是尤為重要的。本文針對目前檢測食品中的沙門氏菌常用的分子生物學方法,包括三種PCR技術、基因芯片技術、環介導等溫技術和焦磷酸測序技術進行了綜述,對分子生物學快速檢測技術與其他學科技術的聯合使用做簡單的介紹,并對這些技術的未來發展進行展望。

分子生物學,沙門氏菌,聚合酶鏈式反應,檢測技術

沙門氏菌是一種革蘭氏陰性桿菌,菌群的種類眾多,由于沙門氏菌對營養的要求不高,所以其分布很廣泛,是一種能夠引起人和畜患病的病原體。肉類(尤其是禽肉)、海產品、蛋類等許多食品都與沙門氏菌病有關,原因是這些食品中含有的營養成分非常豐富,使沙門氏菌生長繁殖速度快,人類攝入含大量沙門氏菌的食品就會引起細菌性感染,進而引發食物中毒[1]。在很多相關的報道中指出生肉是沙門氏菌污染的主要食品[2-4]。在我國,每年發生的細菌性食物中毒事件中,由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位,約占40%[5]。

沙門氏菌的檢測在食源性致病菌的檢測中處于一個重要的位置。目前,包括我國在內的許多國家對沙門氏菌的檢驗普遍采用傳統培養方法,得出檢驗結果大致需4～5 d[6],該方法耗時長,操作復雜,無法滿足市場需求。近幾十年來,隨著分子生物學持續快速地發展,分子生物學方法用于鑒定食源性致病菌的研究也越來越深入,如今多重PCR檢測和在分子生物學基礎上研發試劑盒已經成為國內外研究的熱點,在該領域的研究者也傾向于把分子生物學與微型計算機相結合研發新的檢測技術,各種生物傳感器檢測致病菌的方法也在不斷地被挖掘。常用于檢測沙門氏菌的分子生物學方法主要包括聚合酶鏈式反應(PCR)、熒光定量PCR、基因芯片技術、環介導等溫擴增技術等[7-9]。

1　聚合酶鏈式反應(PCR)技術

1.1常規PCR技術

聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術,是DNA在體外模擬體內進行快速復制的過程。宮強等人[10]根據鼠傷寒沙門氏菌的ompc基因序列設計合成了一對特異性引物對該基因進行特異性擴增,最低檢測限達到了1 pg/μL,減少了實驗成本和實驗時間。Radhika等[11]用invA基因設計一對引物并特異性地檢測出了致病性的沙門氏菌,而在非沙門氏菌中并沒有發現invA基因。當實驗中只有一種基因進行檢測的時候,檢出限相對較低,并且其特異性也很強。武曉松等人[12]建立了應用于檢測蔬菜中沙門氏菌的PCR檢測方法,對180份市售蔬菜樣品進行檢測,6份樣品檢出沙門氏菌,檢出率為3.33%。經過實驗人員的檢測并將這些實驗方法運用于食品的檢測中發現,與傳統的生化檢測方法相比,PCR技術檢測致病菌更加省時,靈敏度方面也有了很大的提高,但是其成本還是相對較高,而且有假陽性的現象產生。

1.2多重PCR技術

多重PCR是指在同一個反應體系中,加入與所測目標菌對應的多對特異性引物,如果能夠得到與這些引物特異性互補的模板,則可同時在同一反應體系中擴增出多條目的基因片段。其反應原理與常規PCR一樣,只是所用的引物為多對。李鳳梅等人[13]對沙門氏菌的invA基因、fliC基因和spvR基因設計三對特異性引物,建立了一個同時檢測雞源致病性沙門氏菌的多重PCR體系,并且得到的檢出限為4.5×102cfu/mL。馮飛等人[14]分別根據沙門氏菌16S rRNA,質粒毒力基因spvC和致病基因 invB、fimA設計4對引物對沙門氏菌進行檢測,實驗中經過一次增菌,并能實現12 h內在人工污染的食品樣品中檢測出沙門氏菌,且靈敏度達到了102cfu/mL。閆晗等人[15]以大腸桿菌的phoA基因、金黃色葡萄球菌的nucA基因和沙門氏菌的invA基因對乳中的這三種致病菌進行多重PCR實驗,結果表明多重PCR檢測方法與國家標準中常規的細菌學檢測方法相比在時間上縮短了12～24 h。研究中,實驗者用多種具有同源性的基因進行了測試,實驗結果都表明了多重PCR大大縮短了檢測時間,提高了檢測的靈敏度,減少了成本,并且在實驗中對實驗條件進行優化后基因條帶都明顯得到擴增而沒有出現雜帶,說明其具有很強的抗干擾性。

多重PCR技術是在單重PCR技術的基礎上進行改良優化的。常規的PCR反應只檢測一種致病菌,而多重PCR實現了在同一個反應體系中同時檢測兩種或兩種以上的致病菌。在這樣多種致病菌同時檢測的情況下,大大減少了檢測所需要的時間,降低了成本。引物的設計對多重PCR實驗成功的影響很大,各引物之間是否設計得合理,是否會造成相互污染是必須考慮的首要問題。食物中的各種成分也會對實驗的結果造成不同程度的影響,所以在進行PCR實驗時,盡量避免人為的污染,以減少實驗誤差。

1.3熒光定量PCR技術

熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光物質,利用熒光信號的積累實時監測整個PCR過程,最后通過繪制已知濃度的標準液的標準曲線對被測模板進行定量分析的方法。傳統的定量PCR從細菌的培養到擴增再到電泳,這個過程非常耗時,只能在終點檢測,而實時熒光定量PCR不需要加入內標,并有效地解決了傳統定量PCR只能在終點檢測的劣勢。現今,熒光定量PCR實驗也發展到了多重檢測的階段,多重熒光定量PCR實驗也是國內外近年來一直在積極研究的一個方向。魏瓊[16]選擇沙門氏菌的invA基因、志賀氏菌的ipaH基因和金黃色葡萄球菌的nuc基因進行三重熒光定量PCR實驗,其利用建立好的體系直接檢測模擬感染細菌樣品,最低檢出限為102cfu/g。楊美榮[17]等人將熒光定量PCR技術應用于飼料中沙門氏菌的檢測中,將熒光定量PCR技術檢測三種樣品的檢測結果與國家標準方法檢測結果進行對比,結果表明了熒光定量PCR技術的特異性更強,其檢測結果與國家標準方法檢測的實驗結果相符,能對飼料進行有效的檢測,具有省時省力的特點。與行業標準SNT1059.7-2010[18]中對沙門氏菌增菌液檢測的檢出限240 cfu/mL相比,研究人員對實時熒光定量PCR技術進行了優化,實驗結果表明檢出限遠低于標準中所規定的檢出限。

與多重PCR檢測技術相比,熒光定量PCR技術是菌的擴增和檢測做到了一步完成,省去了電泳的過程,更快地得到檢測結果。而且這個方法的操作更簡單且自動化的程度更高,同時也不需要后期的處理。與普通PCR技術相比,該方法人為污染的可能性更低。但是Jacobsen等[19]研究表明,以DNA為基礎的熒光定量PCR不能有效地區別死菌和活菌,所以這種檢測技術不適用于含有加熱致死的菌體的樣品,如加工肉制品、即食食品中的沙門氏菌的檢測,比較適用于生鮮食品的檢測。

2　基因芯片技術

1991年Fodor等人提出了生物芯片的概念[20]。基因芯片屬于這其中最早的一種芯片,是指DNA片段經過PCR擴增之后,將這些基因序列標記為未知靶基因序列,將其與集合了大量已知序列探針的基因芯片上特定的基因位點上的探針進行雜交,再通過檢測雜交信號來對基因信息進行分析[21-22]。基因芯片技術在醫學、植物基因檢測、生命科學研究、食品研究及檢測等方面應用也比較廣泛[23-26]。陳昱等人[27]通過設計志賀氏菌ipaH基因、沙門氏菌stn基因和大腸桿菌O157的slt基因的三對特異性引物,用多重PCR技術和基因芯片技術相結合對人工模擬樣品和實際樣品進行檢測,實驗結果表明這兩種方法相互結合檢測這三種菌的靈敏度都可達到50 cfu/mL,而多重PCR電泳的檢測的靈敏度為500 cfu/mL。通過對比實驗發現基因芯片技術不僅在自動化的程度上高于PCR技術,其在檢測靈敏度上也相對較高。基因芯片技術是分子生物學與計算機應用的一種融合,只是目前還沒有具體的標準對基因芯片技術進行一個綜合性的說明。

3　環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術簡稱LAMP技術,是利用具有鏈置換活性的BstDNA 聚合酶,通過識別靶序列上6段特異區域的2條內引物(FIP 和BIP)和2條外引物(F3和B3)在恒溫條件下短時間內催化合成新的鏈,并通過靶基因的擴增產物產生反應出現的焦磷酸鎂的白色沉淀來判斷靶基因是否存在[28-30]。田楨干等人[31]運用LAMP技術針對沙門氏菌的agfA基因進行引物設計,并對54株臨床分離的陽性樣本加以驗證,實驗結果表明分離樣本的符合率達到100%。LAMP技術不僅在檢測的準確率上很高,而且它的靈敏度與普通PCR技術相比也要高出很多。王潤鑫[32]針對沙門氏菌的invA基因進行LAMP引物的改良并檢測,而龐心怡等人[33]用沙門氏菌的特異性基因invA設計引物,并用LAMP技術和PCR技術對人工污染的樣品和實際樣品進行檢測,他們的結果表明都表明LAMP技術的靈敏度可以達到普通PCR技術的100倍。相對于其他的實驗方法,LAMP技術操作更簡單,靈敏度和準確性更高,而且其所需的儀器和試劑相對于PCR技術更低,耗時短[34-35]。

在此基礎之上衍生出了實時熒光LAMP技術。實時熒光LAMP技術是在LAMP反應體系中加入發光的熒光基團,利用熒光信號對LAMP反應進行實時監測,該方法快捷方便、特異性和靈敏度高,并且可以在源頭上控制氣溶膠對反應的污染[36]。雖然LAMP技術一直在改良,但是這一技術還是存在很多問題。比如在引物上的設計它相對于PCR技術來說要難,而且要篩選出合適的引物還需要大量的工作來驗證引物的可靠性,不合理的引物放在同一個管內反應出現假陽性的可能性比較大[37]。如今LAMP技術與實時監測、酶聯免疫吸附實驗、納米金技術、電化學生物傳感器、芯片實驗室等技術的聯用,促進了LAMP技術的推廣,通過改良,實驗檢測的過程更簡單、而且自動化的程度更高,結果也更加直觀和準確,使其在引物設計與產物的特異性檢測和分離等方面的缺陷得到了更好的改進和發展,在簡便性、敏感性以及快速性等方面的優點更加突出,更加適用于基層和實地使用[36,38-39]。

4　焦磷酸測序技術

焦磷酸測序技術是近年發展起來的基于分子水平上的一項快速、準確檢測DNA短序列的微生物檢測技術,并廣泛地應用于病毒檢測[40]、微生物檢測[41]和SNP分析[42]等方面。Islam等人[43]使用新一代16s rRNA基因焦磷酸測序技術,發現了門變形菌門主導OSPW和生物膜,進一步深入分析顯示較高豐度的α-和γ-變形菌序列。曹冬梅等人[44]設計了測序引物和擴增引物對鼠傷寒沙門氏菌的特異性序列進行了檢測,該實驗耗時短,與GenBank中已知的鼠傷寒沙門氏菌DNA序列相比,檢測所得的序列的匹配率為100%。焦磷酸測序技術做到了將微生物進行最本質的序列檢測,這樣在很大程度上提高了檢測結果的準確性。

5　分子生物學方法檢測致病菌的發展前景

本文中的快速檢測方法均為研究人員經過實驗條件的優化最終得到了較為理想的結果,這些分子生物學快速檢測方法在其最優的反應和實驗條件下,實驗結果表明了其有檢出限低,檢測時間與傳統生理生化檢測時間相比大大減少,靈敏度和準確率都達到了一個理想的水平。目前,致病菌快速檢測的標準基本上均為行業標準而沒有上升到國家標準,只有部分檢測標準說明了在該標準所優化的實驗條件下的檢出限比如SNT1059.7-2010[18]。在檢測標準如GBT13091-2002[45]、SNT2641-2010[46]、SN/T2651-2010[47]等中只對結果的判定方法進行了說明,而沒有對實驗的穩定性、準確定和抗干擾性等進行一個系統的規定。

經過幾十年的發展,分子生物學方法的優勢越來越明顯,但是單一的分子生物學檢測方法檢測沙門氏菌都還存在很多待解決的問題,比如在檢測中如何減少甚至避免假陽性的出現或者通過某一種方法達到只檢測出活菌而避免,實驗的準確性需要進一步提高,實驗過程中出現的人為誤差是造成實驗失敗的主要原因,所以檢測技術實現自動化以及計算機與分子生物技術的結合對未來致病菌的檢測尤為重要。近年來,分子生物學方法與其他學期進行結合并對檢測方法不斷地進行改良取得了可喜的研究進展。比如盛翔宇等人[47]用PCR-HRM方法對32株沙門氏菌的fljB、gyrB和ycfQ 3個目的基因進行分型,其分析正確率為96.9%。金玉娟等人[48]運用液相芯片技術聯合多重PCR檢測副溶血性弧菌tdh基因、沙門菌inv A基因、單增李斯特氏菌hly A基因和腸出血性大腸埃希氏菌的stx1基因和stx2基因也取得了很好的實驗結果。沙門氏菌的快速檢測方法在不斷發展,很多試劑盒在不斷被開發。比如姜彥君等人[49]根據沙門氏菌的invA基因、大腸桿菌O157的fliC基因和金黃色葡萄球菌的Nuc基因設計特異性引物,建立了一套快速而且能準確檢測這三種致病菌的試劑盒,這一試劑盒的穩定性強、準確度高、所耗時間少。目前,國內對致病菌的PCR試劑盒的研發也有很高的關注,針對沙門氏菌的各種商品試劑盒就有十來種,但是這一技術相對于國外來說還不是很成熟,所以在試劑盒的建立上還有很大的發展空間。基于分子生物學技術開發的試劑盒的使用和分子生物學與其他檢測技術的聯合,更簡便、快捷的檢測食品中沙門氏菌的污染情況,各學科間的相互借鑒對沙門氏菌的快速檢測可能會成為今后的研究熱點。

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Research progress in molecular biology methods for detection ofSalmonella

YANG Liu1,HU Wen-zhong1,*,JIANG Ai-li1,FENG Ke1,2,WANG Xin1

(College of Life Science,Dalian Nationalities University,Key Laboratory of Biochemical Engineering,The State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education,Dalian 116600,China;2.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

Salmonellais a kind of pathogenic bacteria that can cause human and animal diseases,and it is the first place that the food poisoning incidents caused by them.This paper make a simple summary that aim at the methods of molecular biology for the detection ofSalmonellain food,include three PCR technology,gene chip technology,loop mediated isothermal technology and pyrosequencing,to do a simple introduction of rapid testing of molecular biology technology in conjunction with other disciplines,and to prospects for the future development of these technologies.

molecular biology;Salmonella;PCR;detection technology

2015-11-24

楊柳(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：食源性致病菌檢測，E-mail：771084886@qq.com。

胡文忠(1959-)，男，博士，教授，研究方向：采后生物學與技術，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05)；國家自然科學基金項目(31172009)；大連市科技計劃項目(2012E13SF106)；大連市金州新區科技計劃項目(2012-A1-049)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)09-0372-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.065