ET-1在增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者血和玻璃體中的表達研究

陳 娟，呂紅彬，周 琦，何 躍，歐陽科，石彥婷，曹小蘭

（1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院眼科，四川瀘州 646000；2成都市第五人民醫(yī)院眼科）

ET-1在增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者血和玻璃體中的表達研究

陳 娟1,2，呂紅彬1，周 琦1，何 躍1，歐陽科1，石彥婷1，曹小蘭1

（1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院眼科，四川瀘州 646000；2成都市第五人民醫(yī)院眼科）

目的：通過定量檢測內皮素1（endothelin-1,ET-1）在增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy, PDR）患者血和玻璃體中的表達及其相關性，探索ET-1在PDR的發(fā)病機制中的作用。方法：本研究共納入需行玻璃體切除術的患者65例71眼，分為PDR組及對照組，記錄所有患者年齡、性別、身高、體重、病史、空腹血糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三脂、總膽固醇及糖尿病患者糖尿病病程和糖化血紅蛋白等情況。收集所有患者血清和玻璃體，離心后-80℃冰箱凍存，使用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測血清和玻璃體中ET-1的含量。結果：PDR組和對照組年齡、性別比較均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。PDR組血清ET-1濃度1.82（1.16,2.50）pg/ml高于對照組1.21（0.66,1.79）pg/ml（P= 0.007）；PDR組玻璃體中ET-1濃度5.27（4.03,6.95）pg/ml高于對照組4.19（1.77,5.81）pg/ml（P=0.013）。兩組玻璃體中ET-1濃度均高于血中ET-1濃度，兩組玻璃體和血中ET-1濃度之間無明顯相關性 （rPDR組=0.423,PPDR組=0.07;r對照組=-0.19,P對照組=0.601）。 PDR組空腹血糖、BMI均較對照組高 （P<0.05）；PDR組患者糖化血紅蛋白明顯升高 （P=0.000）。結論：PDR患者血和玻璃體中ET-1水平較正常人群升高。PDR可能發(fā)生于血脂及BMI正常的糖尿病患者。

增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變；內皮素1；血清；玻璃體；血糖

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy,DR）已成為大多數(shù)發(fā)達國家工作人群（20～74歲）的首要致盲眼病[1]。2012年對我國大陸DR流行病學進行的第一份Meta分析表明，我國約有1.3%的人群患有DR，其中NPDR約1.1%，PDR約0.1%；而在糖尿病人群中，DR占23%，其中NPDR占19.1%，PDR占2.8%[2]。

目前對于DR的發(fā)病機制尚有爭議，研究表明糖尿病患者的視網(wǎng)膜毛細血管內皮細胞發(fā)生功能障礙[3]。內皮細胞功能障礙主要表現(xiàn)為內皮起源的舒血管因子與縮血管因子間的不平衡。內皮素1（Endothelin,ET-1）主要是由內皮細胞合成分泌的，具有強大、有效、持久收縮血管功能，ET-1增加是內皮細胞功能障礙的一個重要特點。本研究旨在通過定量測定PDR患者血和玻璃體中ET-1濃度，探討ET-1在PDR發(fā)病機制中可能的作用及PDR患者血和玻璃體中ET-1的相關關系，期望為預防及治療PDR提供一種新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般情況

本實驗選取在西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院眼科就診，需行睫狀體平坦部20G標準三通道玻璃體切除術的患者65例71眼。

1.1.2 入選標準

實驗組：均確診為視網(wǎng)膜脫離、長時間未吸收的玻璃體積血或玻璃體積血合并視網(wǎng)膜脫離，經(jīng)保守治療無效的PDR患者。實驗組患者46例51眼，男性17例19眼，女性29例32眼；年齡28～75歲，平均年齡55.82歲；玻璃體積血不伴視網(wǎng)膜脫離20眼，玻璃體積血伴視網(wǎng)膜脫離21眼，不伴玻璃體積血的視網(wǎng)膜脫離10眼；右眼24眼，左眼27眼；其中高血壓患者21例24眼。

對照組：選擇健康狀況良好，無糖尿病及糖尿病家族史、高血壓、高血脂，且年齡性別與實驗組匹配的孔源性視網(wǎng)膜脫離或全層黃斑裂孔（full thickness macular hole,FTMH）的患者19例20眼，男性6例6眼，女性13例14眼；年齡29～71歲，平均年齡52.70歲；視網(wǎng)膜脫離12眼、FTMH 8眼；右眼11眼，左眼9眼。

1.1.3 排除標準

全身或患眼急性炎癥反應期、患眼內眼手術史、合并其他視網(wǎng)膜血管性病變 （如視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、視網(wǎng)膜靜脈周圍炎等）、本次行玻璃體切除手術前先行白內障手術且手術過程中晶狀體后囊破損、術中眼壓過低不宜在無灌注情況下行玻璃體切除術、肝腎功能不全、肺部疾病、妊娠期或哺乳期、精神疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等患者。

整個實驗中所取得的血標本及玻璃體標本均已經(jīng)過西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理審查委員會審查通過并取得患者及家屬同意。

1.2 方法

記錄所有患者年齡、性別、血壓、身高、體重、眼部診斷、手術眼別等基本情況，測量隨機血糖、空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、血脂包括高密度脂蛋白膽固醇 （high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、 甘油三脂（triglyceride, TG）、總膽固醇（total cholesterol,TC）等生化指標。PDR組患者需測HbA1c，記錄是否使用胰島素注射或者使用口服降糖藥物、術前是否接受視網(wǎng)膜激光光凝治療、糖尿病病程、是否患高血壓病、每日血糖血壓。另取靜脈血約3 ml，4℃，3 000r/min，離心10 min，分離血清，分裝后存放于-80℃超低溫冰箱。在玻璃體切除術開始時未打開灌注管開關前，切取未稀釋的中央玻璃體液0.6～1.0 ml，4℃，15 000 r/min，離心5 min，取上清液，分裝后存放于-80℃冰箱。血清和玻璃體中ET-1水平測定采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA），操作步驟嚴格遵循ELISA試劑盒說明。ET-1試劑盒購自美國R&D公司。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS17.0軟件統(tǒng)計系統(tǒng)對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，滿足正態(tài)分布的各指標采用均數(shù)標準差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗；偏態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（四分位間距）[M（QL,QU）]表示，采用兩獨立樣本資料的Wilcoxon秩和檢驗（Z檢驗）進行分析。計數(shù)資料比較采用χ2比較。兩資料均正態(tài)分布的相關性分析采用Pearson相關分析；其中一個不滿足正態(tài)分布或均不滿足正態(tài)分布的兩資料相關性分析均采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PDR組與對照組患者臨床資料的比較

PDR組與對照組在性別構成和年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩組具有可比性。PDR組與對照組相比，HDL-C、LDL-C、TG、TC等血脂指標差異均沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PDR組FBG、BMI高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。2013年，美國FDA正式批準將HbA1c≥6.5%作為糖尿病的診斷標準。根據(jù)該診斷標準，PDR組HbA1c明顯高于正常，差異具有統(tǒng)計學意義（P＝0.000，表1)。

表1 PDR組與對照組臨床資料比較

2.2 PDR組與對照組血清中和玻璃體中ET-1水平比較

PDR組血清中ET-1濃度顯于對照組血清ET-1濃度，差異具有統(tǒng)計學意義 （Z＝-2.68,P＝0.007）；PDR組玻璃體中ET-1濃度高于對照組玻璃體中ET-1濃度，差異具有統(tǒng)計學意義（Z＝-2.48,P＝0.013）。分別比較PDR組和對照組中血清與玻璃體中ET-1濃度發(fā)現(xiàn)，玻璃體中ET-1濃度高于血清ET-1濃度，差異具有統(tǒng)計學意義 （分別為Z＝-5.999,P＝0.000；Z＝-5.236,P＝0.000，表1）。

表2 PDR組與對照組血清和玻璃體中ET-1水平比較

2.3 PDR組與對照組ET-1濃度相關性分析

將PDR組和對照組患者血清ET-1濃度與玻璃體中ET-1濃度進行相關性分析，差異無統(tǒng)計學意義，（分別為 r＝0.423，P＝0.075；r＝-0.190，P＝0.601）。

表3 PDR組與對照組ET-1濃度相關性分析

2.4 PDR組血清和玻璃體中ET-1濃度分別與臨床資料的相關性分析

將PDR組患者血清和玻璃體中ET-1濃度分別與年齡、糖尿病病程、HbA1c、FBG、血脂等指標進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，僅PDR組患者血清ET-1濃度與年齡關系呈正相關關系（r＝0.551，P＝0.000），其余均無相關性。

3 討 論

ET-1能通過與其受體結合使血管收縮及血管平滑肌細胞增殖[4]。在血糖升高時，ET-1合成增加[5]。血-視網(wǎng)膜內屏障由相鄰的視網(wǎng)膜血管內皮細胞緊密連接形成，是阻止ET-1彌散的主要屏障[6]。當血-視網(wǎng)膜內屏障受損后，血管通透性增加，ET-1將穿過此屏障，作用于血管平滑肌細胞，使血管收縮，引起視網(wǎng)膜血流減少，刺激內皮細胞增殖、遷移，促進新生血管形成[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內ET-1基因表達增加[10]；玻璃體內注射ET-1可引起視網(wǎng)膜血管持續(xù)收縮，血流量減少[11]。

本次實驗觀察到，PDR組和對照組患者玻璃體中ET-1的濃度明顯高于血清中。ET-1這種局部聚集現(xiàn)象可排除血中高濃度ET-1順濃度梯度被動轉運入眼內組織，但不能完全排除ET-1自血中主動轉運入眼的機制。盡管不能完全排除主動轉運機制，PDR組患者玻璃體中ET-1的濃度明顯高于對照組，可能與視網(wǎng)膜、脈絡膜血管床或視網(wǎng)膜色素上皮層產生ET-1并彌散進入玻璃體有關[12]。PDR組患者玻璃體中ET-1濃度高于血清，可能與血-視網(wǎng)膜內屏障破壞，血管通透性增加[13,14]，血液中蛋白滲漏進入眼內組織[15]，局部滲透壓升高后血清中ET-1順濃度梯度進入眼內組織有關。這與Xu等[16]發(fā)現(xiàn)DR患者血ET-1較正常對照組升高的結果一致。Oku等[17]、Patel等[18]也發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體中ET-1升高。盡管多項實驗證明PDR患者血或玻璃體中ET-1水平升高，但也有一些實驗得出不同結果。Adamiec-Mroczek等[19]使用ELISA法檢測19名PDR患者及15名無糖尿病的對照組的血漿中ET-1含量時發(fā)現(xiàn)，PDR組患者血中ET-1濃度與對照組間無明顯差別；Ogata等[20]使用免疫反應方法檢測PDR患者玻璃體中ET水平發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體中ET水平明顯低于非糖尿病組。這與本實驗結果不符，可能與實驗對象的納入排除標準不同、實驗方法不同、標本的采集及保存的條件方法不同以及實驗樣本量不夠大有關。PDR患者血清中ET-1水平明顯高于正常，可通過檢測糖尿病患者血中的 ET-1，快速篩查PDR。

盡管本次實驗未發(fā)現(xiàn)兩組血清與玻璃體ET-1的相關性，但可發(fā)現(xiàn)PDR組P=0.075在統(tǒng)計學的臨界值，擴大樣本量后可能出現(xiàn)統(tǒng)計學差異。通過分析ET-1水平與PDR組患者各項指標的相關性發(fā)現(xiàn)，僅血清ET-1水平與年齡呈正相關關系 （r= 0.551,P=0.000），而在玻璃體中并未發(fā)現(xiàn)類似相關性，可能與PDR患者眼內局部產生ET-1有關。同時提示在通過檢測血中ET-1預測PDR發(fā)生的風險時應考慮年齡因素，且需進一步研究得出血清ET-1在正常人群不同年齡層的分布范圍及不同年齡層的糖尿病無視網(wǎng)膜病變人群血清ET-1的分布范圍。與本次實驗結果相似，Oku等[17]、Donatelli等[21]、Kamoi等[22]、Mather等[23]研究未發(fā)現(xiàn)糖尿病微血管病變患者ET-1濃度與FBG、HbA1c、血壓及病程的相關性。

本次實驗由于對照組患者無糖尿病家族史或病史，無糖尿病臨床癥狀，在正常飲食無降糖治療的情況下，隨機血糖及空腹血糖均在正常范圍，故未測HbA1c。本實驗根據(jù)FDA所提出的糖尿病診斷標準HbA1c≥6.5%進行比較，PDR組患者HbA1c明顯升高（P=0.000），提示血糖控制不理想是糖尿病患者發(fā)生PDR的危險因素之一。這與Chetthakul等[24]研究結果一致。

持續(xù)高血糖可增加DR發(fā)生的風險，Massin等[25]認為FPG>6.0 mmol/L是DR發(fā)生的危險因素，控制糖尿病患者血糖，可減緩視力損害[26]，能有效延緩DR的病程[27]，這與本次實驗結果一致，證實血糖升高是PDR發(fā)生的危險因素。

盡管大量研究發(fā)現(xiàn)PDR患者存在血脂紊亂，但本次實驗未發(fā)現(xiàn)PDR患者血脂異常；盡管PDR組患者BMI升高，但仍在正常范圍內。Wang等[28]研究北京地區(qū)DR的危險因素發(fā)現(xiàn)，將年齡、性別、BMI等進行匹配后，血脂異常與DR的發(fā)生無關，這與本次實驗結果一致。這可能是與本次實驗的研究對象均為需行手術的住院患者，全身情況需經(jīng)藥物控制至穩(wěn)定或飲食生活習慣不一樣有關，故PDR患者血脂不一定異常。

隨著研究的深入，可進一步檢測正常人群不同年齡階段及NPDR患者血中ET-1濃度，了解其表達變化規(guī)律?？蛇M一步建立動物模型探索玻璃體腔注射不同濃度的抗ET-1藥物治療PDR，為將來臨床治療PDR提供新思路。

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（2016-04-20收稿）

Study of endothelin-1 expression in vitreous and serum in proliferative diabetic retinopathy

Chen Juan1,2,Lu Hongbin1,Zhou Qi1,He Yue1,Ouyang Ke1,Shi Yanting1,Cao Xiaolan11Department of Ophthalmology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000, Sichuan Province,China；2Department of Ophthalmology of the Fifth People’s Hospital of Chengdu，Chengdu 611130,Sichuan Province,China

Proliferative diabetic retinopathy,Endothelin-1,Serum,Vitreous，Blood glucose

R774.1

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.007

陳 娟（1987-），女，醫(yī)師，碩士，E-mail：411467775@qq.com

Abstruca Objective:This experiment is to investigate the potential role of ET-1 in the pathogenesis of proliferative diabetic retinopathy （PDR）by detecting the expression of ET-1 in vitreous and serum,and the correlation of the concentration of ET-1 in serum and in vitreous was analyzed.Methods:A total of 65 patients who were candidates for conventional pars plana vitrectomy were divided into PDR group and control group.Age, gender,height,weight,history of diabetes,fasting blood glucose,high density lipoprotein,low density lipoprotein, triglyceride,total cholesterol,duration of diabetes,and glycosylated hemoglobin of PDR patients were recorded. All the serum and vitreous samples were collected and spun down,and the supernatants were then frozen at-80℃. The concentrations of ET-1 in serum and vitreous were determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results:Age and gender difference between the PDR group and control group were not statistically significant（P＞0.05）.The ET-1 concentration in the serum of the PDR group was higher than that in the control group（P＜0.01）.The ET-1 concentration in the vitreous of PDR group was higher than that in the control group（P＜0.05）.Although the concentration of ET-1 in vitreous was increased than that in the serum in the two groups,there was no correlation between vitreous and serum in the two groups （r PDR group＝0.423,P PDR group＝0.075 and control group r control group＝-0.19,P control group＝0.601）.Fasting blood glucose andBMI in the PDR group were higher than those in the control group（P＜0.05）.The glycosylated hemoglobin in the PDR group was significantly increased（P＜0.01）relative to the control group.Conclusion:The concentration of ET-1in the serum and vitreous of the PDR patient is significant higher than that in normal people.PDR may occur in diabetic patients with normal blood lipid and BMI.