尼美舒利對肝癌細胞HepG2增殖及bcl-2和Bax表達的影響

榮 杰 單長民

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尼美舒利對肝癌細胞HepG2增殖及bcl-2和Bax表達的影響

榮 杰 單長民

【摘要】目的 研究尼美舒利對肝癌細胞增殖的影響及作用機制。方法 通過MTT法檢測不同濃度尼美舒利（50μg/ml、100μg/ml、150 μg/ml）對肝癌細胞HepG2 72 h增殖的影響，并通過western-blot方法檢測Bax及bcl-2表達變化。結果 尼美舒利可抑制肝癌細胞HepG2增殖，并且抑制率與作用濃度呈現劑量依賴關系，Bax的表達隨著尼美舒利濃度的升高而逐漸升高，bcl-2則逐漸降低，二者均與尼美舒利作用濃度呈良好的線性關系。結論 尼美舒利可抑制肝癌細胞HepG2增殖，并可增強Bax的表達，抑制bcl-2表達。

【關鍵詞】肝癌，尼美舒利，Bax，bcl-2

原發性肝細胞癌（The hepatocellular carcinoma，HCC）為肝癌的一種，是死亡率最高的惡性腫瘤，也是我國常見的惡性腫瘤之一，其主要病理特征有侵襲性高﹑生長快速﹑轉移早以及預后差等［1］。目前針對肝癌的主要治療手段有手術﹑化療﹑肝移植﹑介入治療等［2］，從一定程度上延長患者的長期生存率，并改善患者的生活質量，但是花費巨大，同時均具有的共同特點是預后差，其整體的治療效果并未改善［3］，因此是臨床治療的難點，也是目前眾多學者研究的重點。但是關于肝細胞癌發生的確切分子機制還不清楚，目前仍然沒有有效的預防措施。本研究擬通過研究尼美舒利對肝癌細胞生長增值的影響，并通過western-blot方法研究其對Bax和bcl-2表達的影響，旨在研究尼美舒利對肝癌細胞生長增殖產生抑制的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

細胞株：肝癌細胞株HepG2由濱州醫學院人體解剖學與組織胚胎學研究所饋贈。

主要試劑及儀器：尼美舒利購自美國sigma公司，RPMI 1640培養基和新生胎牛血清購自GiBco公司，MTT購自美國Bellancom公司，兔源Bax一抗，兔源bcl-2一抗和兔源β-actin一抗均購自中杉金橋公司，倒置相差顯微鏡 TS-100購自日本Nikon公司，CO2培養箱購自美國Thermo公司，蛋白電泳儀，轉膜儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測尼美舒利對肝癌細胞增殖影響 取培養至對數期的HepG2細胞，接種于96孔板內，細胞濃度為10×104個/ml，每孔接種量為100 μl，分別加入RPMI 1640培養基配置成各濃度尼美舒利溶液至終濃度依次為50μg/ml﹑100μg/ml﹑150μg/ml，每個濃度設6個復孔，同時設立含0.1%二甲基亞砜的RPMI1640培養基溶液為陰性對照組，也設6個復孔。培養72 h后MTT法檢測細胞生長抑制率。細胞生長抑制率（%）=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%，結果由（均數±標準差）（±s）表示。

1.2.2 western-blot檢測尼美舒利對肝癌細胞HepG2 Bax和bcl-2蛋白表達影響 取尼美舒利作用72 h后的HepG2細胞，裂解細胞后，12 000 rpm離心5 min，吸取上清液，加入5×上樣緩沖液，95℃煮10 min，12%分離膠SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜，5%脫脂乳37℃封閉2 h，加入一抗Bax﹑bcl-2和β-actin（1：10 000），4℃孵育過夜，加入羊抗兔-HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，ECL曝光液曝光，顯影，定影，用 LabWork4.5 分析軟件測定Bax﹑bcl-2和β-actin吸光度值，以β-actin為內參，分別計算Bax﹑bcl-2和β-actin的比值為其相對表達量。

2 結果

2.1 MTT法檢測尼美舒利對肝癌細胞HepG2生長抑制作用

不同濃度尼美舒利（50μg/ml﹑100μg/ml﹑150μg/ml）作用于肝癌細胞HepG2 72 h后，發現細胞抑制率隨作用濃度升高呈現劑量依賴關系，即隨著作用濃度的升高，對肝癌細胞HepG2抑制率逐漸上升，在150μg/ml濃度下對肝癌細胞HepG2生長抑制率為42.37%，接近50%，且陰性對照組細胞抑制率基本為零，說明1‰濃度DMSO對肝癌細胞HepG2生長無抑制，而尼美舒利可有效抑制肝癌細胞HepG2生長和增值，且抑制效果與其濃度呈正相關。見圖1。

圖1　不同濃度尼美舒利對肝癌細胞HepG2生長抑制率結果

2.2 Western-blot檢測尼美舒利對肝癌細胞HepG2 Bax和bcl-2表達結果的影響

尼美舒利作用后Bax在肝癌細胞HepG2表達升高，bcl-2在肝癌細胞HepG2表達則逐漸降低，且與尼美舒利濃度呈良好的線性關系，并且經一維方差差異性統計分析之后各濃度尼美舒利濃度組與陰性對照組肝癌細胞HepG2中Bax和bcl-2的表達差異具有統計學意義，P＜0.05。見圖2，圖3。

圖2　尼美舒利對肝癌細胞HepG2 Bax及bcl-2表達結果的影響

圖3　尼美舒利對肝癌細胞HepG2 Bax及bcl-2表達結果的影響

3 討論

尼美舒利（nimesulide）是由美國化學家GEORGE合成的磺酰苯胺類非甾體抗炎藥（non-steroidal antiinflammatorydrugs，NSAIDs）。該藥1974年獲美國專利，1980年轉讓瑞士赫爾辛公司（HelsinnHealthcare SA），1985年在意大利率先上市［4］。研究認為NSAIDs抗腫瘤作用主要與環氧合酶（cyclooxygenase，COX）有關，環氧合酶有兩種異構酶：COX-1和COX-2。其中，COX-2與腫瘤關系密切。Shiota等通過免疫組化染色研究發現，29例患者肝癌組織中有28例COX-2染色陽性，即陽性率為97%，在這28例陽性患者中含有7例高分化﹑3例中度分化和3例低分化患者，且癌組織與癌旁非癌組織相比COX-2染色要強，且在高分化肝癌患者組織中COX-2的表達率高于中度分化和低分化的肝癌組織（P＜0.05）［5］。且有研究發現COX-2與肝癌的分化程度﹑轉移及預后均密切相關，Kondo等通過研究發現，COX-2在肝癌腫瘤術后表達高者生存率低［6］。因此，COX-2可能對肝癌的發生﹑發展﹑侵襲和轉移具有始動或促進作用，以COX-2為靶點的研究可能為臨床有效治療肝癌提供新的方向。有研究表明非甾體抗炎藥尼美舒利可促進肝癌細胞凋亡，并能增加肝癌細胞對傳統化療藥的敏感性，但其具體作用機制并不清楚［7-8］。潘躍銀等研究發現尼美舒利與阿霉素聯合應用具有協同抑制人肝癌細胞株HepG2細胞增殖與誘導其凋亡作用［9］。殷國志等研究發現，尼美舒利可誘導人肝癌SMMC7721細胞凋亡，這一作用可能與抑制HSP70表達有關［10］。本研究通過MTT法檢測不同濃度尼美舒利（50μg/ml﹑100μg/ml﹑150μg/ml）作用于肝癌細胞HepG2 72 h后，發現細胞抑制率隨作用濃度升高呈現劑量依賴關系，且在150μg/ml濃度下對肝癌細胞HepG2生長抑制率為42.37%，接近50%；通過western-blot方法及RT-PCR方法研究Bax和bcl-2在尼美舒利作用后表達變化，發現Bax在肝癌細胞HepG2表達升高，且隨著尼美舒利濃度的升高而逐漸升高，bcl-2則表達降低，二者均與尼美舒利作用濃度呈良好的線性關系。

綜上所述，尼美舒利對肝癌細胞HepG2增殖具有抑制作用，可增強肝癌細胞HepG2中Bax的表達，并抑制bcl-2的表達，這為尼美舒利抑制肝癌細胞增殖作用機制提供了理論依據。

參考文獻

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Effect of Nimeisulide on Liver Cancer Cell HepG2 Proliferation and the Expression of blc-2 and Bax

RONG Jie SHAN Changmin Binzhou Medical University，Yantai 264003，China

【Abstract】

Objective To investigate the effect of nimeisulide on liver cancer cell proliferation and the possible function mechanism.Methods To detect the cell viability of HepG2 through MTT assay after treated with nimeisulide 72 h at different concentrations（50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml），and to detect the expression of Bax and bcl-2 by western-blot method.Results Nimeisulide could inhibit the proliferation of HepG2 liver cancer cells，and inhibition rate presented dose-response relationship with nimeisulide concentrations，the expression of Bax increased with rising of concentration of nimesulide，but bcl-2 decedent，which both presented dose-response relationship with nimeisulide concentrations.Conclusion Nimeisulide could inhibit the proliferation of HepG2 liver cancer cells，and also could increase the expression of Bax，but decrease the expression of bcl-2.

【Key words】Liver cancer，Nimeisulide，Bax，bcl-2

通訊作者：單長民，E-mail：674650785@qq.com

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.02.065

【中圖分類號】R735.7

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）02-0087-03

作者單位：264003煙臺，濱州醫學院