豬乙腦傳代細胞活疫苗（SAl4-14-2株）對仔豬的安全性試驗

潘　文，韓　偉，姜國華，郝霖雨（.中牧實業股份有限公司中牧研究院農業部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室，北京海淀00070；.中國農業科學院生物技術研究所，北京海淀0008）

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豬乙腦傳代細胞活疫苗（SAl4-14-2株）對仔豬的安全性試驗

潘文1，韓偉1，姜國華2，郝霖雨1
（1.中牧實業股份有限公司中牧研究院農業部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室，北京海淀100070；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京海淀100081）

摘要：評價以Vero細胞為基質的豬乙腦傳代細胞活疫苗（SA14-14-2株）對仔豬的安全性，將豬乙腦傳代細胞活疫苗，通過1次超劑量（10倍劑量）免疫40～45日齡的仔豬，同時設立病毒液組、凍干保護劑組、空白對照組，監測仔豬體溫和臨床癥狀，采集免疫前和免疫后第1、2、3、5、7天血漿，仔豬于免疫后第14天無菌取腦組織。對采集的血樣及腦組織進行蝕斑檢測，并對血樣及腦組織盲傳3代的細胞培養液進行RT-PCR檢測。結果，試驗豬免疫前后臨床觀察、體溫，免疫后接種部位均未見異常。蝕斑法和RT-PCR法檢測各試驗組仔豬血漿和腦組織提取液均未檢出乙腦病毒。表明以Vero細胞為基質的豬乙腦傳代細胞活疫苗（SA14-14-2株）對仔豬是安全的。

關鍵詞：流行性乙型腦炎；SA14-14-2減毒株；Vero細胞；疫苗；安全性

流行性乙型腦炎（乙腦）是由乙型腦炎病毒（JEV）引起的一種蚊媒性人獸共患的傳染病。豬群感染最為普遍，懷孕母豬可表現為高熱、流產、死胎和木乃伊胎，公豬則出現睪丸炎。乙腦病毒主要存在于中樞神經系統、腦脊液、血液和死胎仔豬的腦組織中。

目前，我國用于預防豬乙腦感染的疫苗主要是豬乙型腦炎減毒活疫苗（SA14-14-2株）。該疫苗采用原代地鼠腎細胞作為病毒培養基質，生產中存在地鼠來源緊張、生產成本高、產量低、外源因子多、批次差異大等缺點。

1995年，世界衛生組織（WHO）推薦Vero細胞可作為生產疫苗的細胞基質。以Vero細胞為基質生產的疫苗均顯示出了良好的安全性和免疫原性，1998年，Vero細胞乙型腦炎滅活疫苗（P3株）被批準上市，用于人類乙腦的免疫接種，研究以Vero細胞為基質的豬乙腦活疫苗（SA14-14-2株）也將具有較好的應用前景。

本試驗通過一次超劑量免疫40～45日齡的仔豬評價以Vero細胞為基質的豬乙腦傳代細胞活疫苗（SA14-14-2株）的安全性，為SA14-14-2株豬乙腦傳代細胞活疫苗的研制提供了試驗基礎。

1　材料

1.1細胞、病毒、血清BHK-21細胞、Vero細胞株，均購自于中國獸醫藥品監察所。

乙腦病毒液，是用Vero細胞將乙腦SA14-14-2株傳至F10代的病毒液，病毒含量為6.20 log PFU/mL。陽性對照，是用BHK-21細胞將乙腦SA14-14-2株培養至F7代的病毒液。豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬偽狂犬病病毒（PRV），均由中國農業科學院生物技術研究所姜國華老師提供。

1.2主要試劑及培養基DMEM、MEM為Gibco公司產品；胎牛血清為Hyclone公司產品；水解乳蛋白、胰酶、甲基纖維素、肝素納、結晶紫，均為Sigma公司產品。Qiagen onestep RT-PCR Kit、DNA Ladder Marker、Nuclease Inhibitor、Trizol試劑為Qiagen公司產品。豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒為武漢科前動物生物制品有限責任公司產品。

1.3試驗動物40～45日齡乙腦抗體陰性健康易感仔豬。

2　方法

2.1試驗豬的篩選及分組對140只30日齡的仔豬分別進行乙腦ELISA抗體檢測試劑盒檢測和血凝抑制試驗，篩選乙腦抗體雙陰性健康仔豬。試劑盒檢測按照試劑盒說明書操作，血凝抑制試驗按照“SNT1445-2004動物流行性乙型腦炎微量血凝抑制試驗”操作。

取篩選獲得的乙腦抗體雙陰性健康仔豬分為4組，耳后肌肉注射，每組5頭。第1組每頭豬注射10倍劑量豬乙腦傳代細胞活疫苗；第2組每頭豬注射10倍劑乙腦病毒液；第3組每頭豬注射10倍劑量（10 mL）凍干保護劑；第4組為空白對照組，不免疫。

2.2臨床觀察與樣品采集免疫前，觀察仔豬5 d，每天飼喂前測量體溫。免疫后觀察14 d，每天飼喂前測量體溫；采集免疫前和免疫后第1、2、3、5、7天血漿，仔豬于免疫后第14天剖殺，無菌取腦組織。

2.3血漿和腦組織的蝕斑檢測將各試驗組仔豬的血漿樣本和腦組織提取液分別接種BHK-21細胞單層，并用DMEM甲基纖維素半固體培養基于37℃覆蓋培養3～4 d，經固定及染色后，若出現病毒蝕斑，且經乙腦病毒特異性鑒定（標準血清中和培養法）為陽性，即判定血漿樣本和腦組織提取液乙腦病毒檢測為陽性，否則為陰性。

2.4血漿和腦組織盲傳3代的細胞培養液的RTPCR檢測

2.4.1JEV-RNA模板的制備按照RNA提取方法[1]提取血漿和腦組織盲傳3代細胞培養液中的乙腦病毒RNA。

2.4.2引物合成根據“GB/T 22333-2008日本乙型腦炎病毒反轉錄聚合酶鏈反應試驗”方法中公布的引物基因序列，由北京三博遠志生物科學技術有限公司合成引物。

2.4.3RT-PCR反應用Qiagen一步RT-PCR試劑盒配套緩沖液及酶體系，反應液體系（25 μL）為：5×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上下游引物3 μL，混合酶液1 μL，5-Q solution 5 μL，RNAse inhibitor 0.3 μL，RNA模板9.7 μL。反應程序為50℃30 min，95℃預變性15 min；94℃0.5 min，50℃0.8 min，72℃1 min，40個循環，最后72℃延伸10 min。

2.4.4特異性檢測用RT-PCR方法擴增JEV、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV等病毒，檢測該方法的特異性。

2.4.5敏感性檢測將乙腦病毒液進行10倍倍比稀釋后，提取RNA，進行RT-PCR檢測擴增，評價該方法的敏感性。

2.5RT-PCR檢測血漿和腦組織盲傳3代的細胞培養液血漿和腦組織提取液檢測為乙腦陰性的樣本，用含2%小牛血清DMEM培養基于BHK-21細胞單層中，35℃條件下連續盲傳3代后用RT-PCR方法進行檢測。

3　結果與分析

3.1試驗豬的篩選結果對140只30日齡的仔豬分別進行乙腦ELISA抗體試劑盒檢測和血凝抑制試驗，篩選出25頭乙腦抗體雙陰性健康仔豬，乙腦抗體雙陰性檢測率為17.86%，取其中20頭仔豬用于試驗。

3.2試驗豬體溫、臨床觀察結果試驗期間，試驗豬體溫均保持在37.0℃～39.5℃之間，免疫后未見試驗豬體溫升高至40℃以上，且接種部位均未見異常，臨床狀態觀察，采食、精神狀態均正常。

3.3血漿和腦組織的蝕斑檢測蝕斑法檢測各試驗組仔豬血樣均未檢出病毒血癥，仔豬腦組織提取液病毒檢測均為陰性（表1）。

表1　血漿和腦組織的蝕斑檢測結果

圖1　RT- PCR檢測J EV的特異性結果M：600 bp DNA ladder Marker；1：豬傳染性胃腸炎病毒；2：豬瘟病毒；3：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；4：豬偽狂犬病病毒；5：豬乙型腦炎病毒；6：空白對照

3.4RT-PCR檢測JEV的特異性檢測JEV，可擴增到與預期大小相符的375 bp的特異性目的片段，而對PRRSV、CSFV、PRV、TGEV等病毒進行檢測，均未檢出特異性條帶（見圖1）。3.5 RT-PCR檢測JEV的敏感性將已知病毒含量的乙腦病毒液，進行10倍倍比稀釋，RT-PCR可檢出的最高稀釋滴度為10-4。經計算本試驗采用RT-PCR法檢測的最低JEV病毒粒子約為55個，如圖2所示。

圖2　RT- PCR檢測J EV的敏感性結果M：600 bp DNA ladder Marker；1：10-5稀釋度；2：10-4稀釋度；3：10-3稀釋度；4：10-2稀釋度；5：10-1稀釋度；7：毒價為6.2 log PFU/mL的乙腦毒液

3.6RT-PCR檢測血漿和腦組織盲傳3代的細胞培養液RT-PCR檢測血漿和腦組織盲傳3代的細胞培養液結果均為陰性，與上述3.3結果一致。圖3為RT-PCR檢測乙腦疫苗免疫組5頭仔豬腦組織盲傳3代的細胞培養液的結果。

圖3　RT- PCR檢測乙腦疫苗免疫組5頭仔豬腦組織盲傳3代的細胞培養液結果M：600 bp DNA ladder Marker；1-5：分別為乙腦疫苗免疫組5頭仔豬腦組織盲傳3代的細胞培養液；6：陽性對照BHK-21培養的SA14-14-2 F7代毒液；7：空白對照

4　討論

SA14-14-2株原代地鼠腎細胞乙腦減毒活疫苗能誘導產生體液和細胞雙重免疫應答[2]，注射針次少，副反應低，效果明顯優于滅活疫苗，已在國內外廣泛應用并證明十分安全[3-5]，但考慮實際疫苗生產過程中培養基質的均一性和疫苗質量的可控性、安全性等問題，選擇Vero細胞進行疫苗生產具有更大的優勢，目前國內獸醫領域還未見以Vero細胞為基質制備豬乙腦活疫苗（SA14-14-2株）的報道，本試驗以Vero細胞為基質制備了豬乙腦傳代細胞活疫苗（SA14-14-2株），并在40～45日齡仔豬上進行了該疫苗的安全性研究。

仔豬接種后，免疫組、病毒液組均未形成由豬乙腦SA14-14-2株引起的病毒血癥，仔豬腦組織中也未檢測出乙腦病毒，免疫組、病毒液組、耐熱保護劑組的仔豬注射部位及臨床癥狀均未見異常反應，說明SA14-14-2株乙腦病毒進入豬體后未引發豬乙腦相關的病癥，且活疫苗中的細胞基質、保護劑配方等成分對仔豬是安全的。

本試驗除了使用傳統的“蝕斑法”對血漿和

腦組織進行乙腦病毒檢測外，還對血樣及腦組織盲傳3代的細胞培養液進行了RT-PCR檢測，RT-PCR方法不僅簡便、快捷，還具備敏感性高，特異性強的優點，可以大大提高檢樣的效率。

本試驗后續開展的豬乙腦傳代細胞活疫苗（SA14-14-2株）的免疫原性等其他相關試驗必將為豬乙腦的防控帶來積極的影響。

參考文獻：

[1]高正琴，岳秉飛，賀爭鳴.乙腦病毒RT-PCR檢測方法的建立及應用[J].藥物分析雜志，2010，30（10）：1928-1931.

[2]李茂光，俞永新，劉欣玉.SA14-14-2株流行性乙型腦炎減毒活疫苗與滅活疫苗誘導小鼠細胞免疫應答的比較研究[J].中國疫苗和免疫，2010，16（4）：334-339.

[3]俞永新.流行性乙型腦炎減毒活疫苗的發展和應用[J].上海預防醫學，2006，18（3）：110-112.

[4]俞永新.基于SA14-14-2減毒株的新型乙型腦炎疫苗的研究進展[J].中國病毒病雜志，2012，2（3）：161-167.

[5]許樂燕，徐聞青，徐帆洪.乙型腦炎病毒SA14-14-2減毒疫苗株的生物學和基因穩定性[J] .中國生物制品學雜志，2008，21（10）：833-837.

Thesafety test of the J E live SA14- 14- 2 vaccinegrown on VERO cells in piglets

PAN Wen1，HAN Wei1，JIANG Guo-hua2，HAO Lin-yu1
（1.Zhongmu Institute，China Animal Husbandry Industry CO.LTD，Beijing 100070，China；2.Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：To evaluate the safety of the epidemic encephalitis（JE）live（SA14-14-2）vaccine prepared using VERO cells in piglets.Ten time doses of JE live SA14-14-2 vaccine，JE virus，and protectant were inoculated in five 40-45-day-old piglets，respectively.Meanwhile blank control was set up.The piglets body temperature was measured and clinical status was observed everyday.Blood plasma samples were collected before immunization and after immunization at day 1，2，3，5，and 7.The whole brain tissue was sterilely separated at day 14 post-immune challenge.JE virus in plasma and brain tissue was detected by plaque-forming test. JE virus in three blind passages of plasma and brain cultivated on BHK-21 cells were detected by RT-PCR test.The clinical observation and body temperature of piglets before and after immunization，and vaccination site after immunization showed no abnormalities. JE virus in plasma and brain tissue was not detected by plaque-forming test and RT-PCR test.JE live SA14-14-2 vaccine cultivated on VERO cells is safe for piglets.

Key words：J E；SA-14-14-2 attenuated virus strain；VERO cells；vaccine；safety Corresponding author：HAO Lin-yu

通訊作者：郝霖雨，E-mail：hly29@sohu.com

作者簡介：潘文（1985-），女，碩士，主要從事動物疫苗研發工作，E-mail：Pstone1985@163.com

收稿日期：2014-03-21

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0031- 03