功勞葉提取物的體外抗菌活性研究

蒲忠慧，王保山，陳希文，王雄清，鄧思霞，周小琴（.綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川綿陽6000；.北京生泰爾生物科技有限公司，北京大興0600）

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功勞葉提取物的體外抗菌活性研究

蒲忠慧，王保山2，陳希文1，王雄清1，鄧思霞1，周小琴1
（1.綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川綿陽621000；2.北京生泰爾生物科技有限公司，北京大興102600）

摘要：采用水提法和乙醇回流加熱法分別提取功勞葉，應用牛津杯法和試管二倍稀釋法分別檢測功勞葉提取物對試驗菌的抑菌圈直徑、最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Consistency，MIC）和最低殺菌濃度（Minimum Bactericidal Consistency，MBC）。結果顯示，功勞葉醇提物金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為20.69 mm、15.40 mm；MIC值分別是31.3 mg/mL、125 mg/mL；MBC值分別是62.5 mg/mL、＞500 mg/mL。功勞葉水提物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈13.54 mm，其MIC值、MBC值分別是62.5 mg/mL、500 mg/mL，對大腸桿菌抗菌活性較弱，其MIC值為500 mg/mL，MBC＞500 mg/ mL。功勞葉不同提取物對細菌的抗菌活性有所差異，功勞葉醇提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均由不同程度的抑菌或殺菌能力。

關鍵詞：功勞葉；抗菌活性；MIC；MBC

十大功勞（Mahonia japonica）屬于小檗科（Ber?beridaceae）十大功勞屬（Mahonia），該屬植物為多年生小灌木[1]，資源豐富，產量多，在我國民間藥用已久，以根、莖入藥的稱為功勞木，以葉入藥的稱為功勞葉。現代藥理研究證明，功勞葉具有抗菌[2]、消炎[3]、抗癌[4-5]、抗病毒、抗心率失常、抗血小板聚集以及清熱燥濕、瀉火解毒的功效[1]。其主要活性成分為小檗堿[6]，又稱黃連素，臨床上用于細菌性痢疾、傷寒、肺結核、急性扁桃體炎等癥。

近年來，關于十大功勞屬植物主要集中于其化學成分進行的研究，雖有功勞在抗病原微生物的初步應用探索[3，7]，但對畜禽細菌性疾病的主要致病菌的抑制作用報道較少。基于此，本研究擬選用當地生長的功勞葉，采用水提法與醇提法分別對豬源的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行抑菌試驗，旨為在畜禽疾病防治中充分利用當地資源和進一步開發植物藥提供了新的途徑。

1　材料與方法

1.1菌株與培養基致病菌：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，均由綿陽師范學院生物基礎實驗中心從綿陽市某豬場患病豬的病料中分離所得。

MH肉湯培養基（Mueller-Hintonbroth），購自北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20130726；營養瓊脂培養基（Nutrienta agar），購自北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20130702。

1.2中藥功勞葉（產地四川，批次130350），購自成都中藥材市場。按照《中華人民共和國獸藥典》（2010年版二部）十大功勞屬項下鑒定合格。

1.3器材旋轉蒸發儀R502B（上海亞榮生化儀器廠）；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司）；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；DNP-9052BS—Ⅲ電熱恒溫培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）；SYC-C電熱恒溫調速振蕩器（上海新苗醫療器械制造有限公司）；牛津杯內徑（6.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm。

1.4功勞葉粗提物的制備將功勞葉粉碎后過20目篩，分別用95%乙醇回流提取、水煎煮。料液比1∶12，每種溶劑重復提取3次，時間分別為3 h、2 h、1 h。將每種溶劑3次所得濾液減壓濃縮至生藥質量濃度為2 g/mL，真空干燥至恒重，精密稱量，計算浸膏得率。

1.5體外抑菌試驗

1.5.1菌懸液的制備將供試菌種接種于營養瓊脂斜面培養基上進行活化，37℃恒溫培養18～24 h，然后在超凈工作臺內用接種環挑取活化后的單個菌落接種于新鮮的MH肉湯培養基中，置37℃恒溫箱中培養18～24 h作為原菌液，采用平板菌落計數法，用無菌生理鹽水將受試菌株調至1×106～107CFU/mL，備用[8]。

1.5.2牛津杯法測定抑菌活性采用牛津杯法測定抑菌活性[9]。用微量移液器吸取0.2 mL菌液于制備好的營養瓊脂固體培養基中，用無菌玻璃耙涂布均勻，并用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養皿中。在水平放置的平皿中均勻地放置4個牛津杯，其中3個各加入同種藥液50 μL，另外1個加入相應的溶劑作陰性對照。隨后放入37℃恒溫培養箱中培養24 h后，移去牛津杯，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑（按十字交叉法測量菌落直徑2次，取其平均值）。

抑菌效果判定[10]：抑菌圈直徑＞20 mm為極敏感；在15～20 mm為高度敏感；在10～15 mm之間為中度敏感；抑菌圈直徑＜10 mm為低度敏感。

1.5.3最小抑菌濃度的測定采用試管二倍稀釋法[11-12]。取已滅菌且編號試管9支，先在1～8號試管加MH肉湯2 mL，然后吸取功勞葉提取物（濃度為1 g/mL）2 mL移入1號試管，充分混勻后倍半稀釋，向上述每管加菌懸液50 μL，同時設MH對照管、菌液對照管，使每管中的藥物濃度分別為500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.3 mg/mL、15.6 mg/mL、7.8 mg/mL、3.9 mg/mL。每管3個重復，置37℃置搖床（150 r/min）培養24 h后，肉眼觀察試管內液體澄清的最低藥物濃度記為最低抑菌濃度（MIC）。

1.5.4最小殺菌濃度的測定在MIC結果的基礎上，從肉眼可見無渾濁的試管中吸取50 μL液體涂布于營養瓊脂固體平板上[13]，37℃恒溫培養24 h后，以殺滅99.9%細菌數量的最低濃度或者培養板上無菌落生長的最低濃度記為MBC。試驗重復3次。

2　結果

2.1功勞葉粗提物的抑菌活性比較采用牛津杯法分別測定了功勞葉水提物、醇提物在2 g/mL的生藥濃度下為對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外抑菌活性，結果見表1及前插彩版圖1～3。由表1可知：與陰性對照相比：功勞葉醇提物對2種供試菌具有不同程度的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑為20.69 mm；呈極敏性，對大腸桿菌（15.40 mm）表現出高敏性；功勞葉水提物對金黃色葡萄球菌抑菌效果相對較好，抑菌圈直徑為13.54 mm表現出中敏性，對大腸桿菌抑菌直徑＜10 mm為低度敏感。以上結果說明了功勞葉醇提物抑菌效果優于水提物，從提取得率來看，水提物得率（16.64%）略高于醇提物（13.58%）。

表1　功勞葉提取物對供試菌的體外抑菌活性

2.2最低抑菌濃度（MIC值）采用試管二倍稀釋法測定了功勞葉提取物對供試菌的MIC值，結果見表2，當功勞葉醇提物的濃度為31.3 mg/mL時，金黃色葡萄球菌生長受到抑制，試管中液體培養基澄清，當醇提物濃度為125 mg/mL，大腸桿菌生長明顯受到抑制；當功勞葉水提物的濃度為250 mg/mL時，金黃色葡萄球菌生長受到抑制，當水提物濃度為500 mg/mL，大腸桿菌試管仍顯渾濁。陰性對照組中各試驗菌均表現出較強的生長優勢。由此得出，功勞葉醇提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值分別為：31.3 mg/mL、125 mg/mL；功勞葉水提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值分別為：250 mg/mL、＞500 mg/ mL。

2.3最低殺菌濃度（MBC值）在最低抑菌濃度的基礎上，測得的MBC值結果見表3。由表3可知，功勞葉醇提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MBC值分別為：62.5 mg/mL、500 mg/mL；功勞葉水提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MBC值分別為：500 mg/mL、＞500 mg/mL。

3　討論

本試驗探討了乙醇、水堤物對功勞葉活性成分抑菌效果的影響，結果顯示，功勞葉醇提物抑菌效果優于水提物，根據“相似相溶”原理可知，其極性強弱為水＞乙醇，由此說明了功勞葉抑菌成分可能為中等極性成分。

表2　功勞葉提取物對供試菌的最低抑菌濃度　（MIC值）

表3　功勞葉提取物對供試菌的最低殺菌濃度　（MIC值）

體外抑菌試驗表明，不同的菌種對藥物的敏感度不同。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌對功勞葉醇提物分別表現為極敏（20.69 mm）和高敏（15.40 mm）；對水提物分別表現出中敏（13.54 mm）和低敏（＜10 mm）。由此說明了革蘭陽性菌對功勞葉提取物的敏感性大于革蘭陰性菌），即功勞葉革蘭陽性菌的抑制作用強于革蘭陰性菌。據金蘭梅等[14]報道，功勞葉對金黃色葡萄球菌抑菌效果較強，且優于大腸桿菌，與本試驗的結果相符，說明功勞葉抑菌譜廣，具有較大的開發價值，但其抑菌活性具體成分尚不明確，有待進一步分離純化。

功勞葉提取物對供試菌的MIC值、MBC值結果表明，功勞葉醇提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有一定的抑菌和殺菌效果，對金黃色葡萄球菌的MIC值為31.3 mg/mL，MBC值為62.5 mg/ mL；對大腸桿菌的MIC值為125 mg/mL，MBC值為500 mg/mL。功勞葉水提物僅對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，其MIC值為250mg/mL，MBC值為500 mg/mL，對大腸桿菌的MIC與MBC值均大于500 mg/mL。在抑制大腸桿菌方面，張秀英等[15]報道十大功勞葉水提物對大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）范圍為15.6～250 mg/mL（生藥），醇提物對大腸桿菌的的MIC均大于250 mg/mL（生藥），周琰冰等[16]、趙鑫薈等[17]報道，功勞葉大腸桿菌的MIC為62.5 mg/mL，本研究結果與以上報道相比有明顯的差異，出現這種差異可能與功勞葉的種類、產地、提取方法，以及相同的細菌不同來源的菌株有關，有待今后進一步探討。

臨床研究證明[18-20]，功勞葉體內治療許多感染性疾病（細菌性痢疾、流感病毒、傷寒、肺結核、急性扁桃體炎）效果很好，但本研究結果表明，其體外MIC值偏大，究其原因可能與功勞葉的抑菌機理有關，功勞葉可能與抗生素作用機制不同，其是否作用于毒素表達、表面蛋白活性或耐藥性等方面，有待于進一步的研究。

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Studies on the Antimicrobial Activity of Extract from Mahoniain vitro

PU Zhong-hui，WANG Bao-shan2，CHEN Xi-wen1，WANG Xiong-qing1，DENG Si-xia1，ZHOU Xiao-qin1
（1.College of Life Science and Technology of Mianyang Normal University，Mianyang 621000，China；2.Beijing Centre Biology Co.，Ltd.Beijing 102600，China）

Abstract：The extracts of Mahonia was prepared by water extraction and 95%ethanol refluxing method . Two extracts were used to do drug sensitive test by Oxford Plate and the tube dilution method was used to determine the Minimum Inhibitory Consistency（MIC）and Minimum Bactericidal Consistency（MBC）against Staphylococcus aureus and Escherichia coli.The results showed that antibacterial circle diameter of the ethanol extraction against Staphylococcus aureus and Escherichia coli was 20.69 mm and 15.40 mm，the MIC was 31.3 mg/mL and 125 mg/mL，and the MBC was 62.5 mg/mL and greater than 500 mg/mL，respectively.Antibacterial circle diameter of the water extraction against Staphylococcus aureus was 13.54 mm，the MIC and MBC were 62.5 mg/mL and 500 mg/mL，respectively.Escherichia coli was less sensitive to the water extraction of the Mahonia.The MIC was 500 mg/mL and the MBC was greater than 500 mg/mL.Different extracts showed different antibacterial activities to Staphylococcus aureus and Escherichia coli.The Mahonia ethanol extraction has good inhibitory effect on Staphylococcus aureus and E.coli.

Key words：Mahonia；antimicrobial activity；MIC；MBC

Corresponding author：WANG Xiong-qing

通訊作者：王雄清，E-mail：wangxq193@126.com

作者簡介：蒲忠慧（1982-），女，講師，博士生，從事中藥藥理研究，E-mail：zhonghui.pu@163.com

基金項目：四川省科技廳科研項目（2013JY0127）

收稿日期：2014-11-28

中圖分類號：R 281.4

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0109- 03