黃喉擬水龜致病菌-維氏氣單胞菌的鑒定及藥敏試驗

何成偉，鐘　勇，段保屹，廖春林，唐慧英，廖海燕，梁中平（.廣西憑祥出入境檢驗檢疫局，廣西憑祥5600；.廣西憑祥市水產畜牧獸醫局，廣西憑祥5600；.廣西憑祥市科技局，廣西憑祥5600）

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黃喉擬水龜致病菌-維氏氣單胞菌的鑒定及藥敏試驗

何成偉1，鐘勇1，段保屹1，廖春林1，唐慧英2，廖海燕3，梁中平1
（1.廣西憑祥出入境檢驗檢疫局，廣西憑祥532600；2.廣西憑祥市水產畜牧獸醫局，廣西憑祥532600；3.廣西憑祥市科技局，廣西憑祥532600）

摘要：對患病黃喉擬水龜（Mauremys mutica）進行細菌學檢查和分離，對分離到1株革蘭陰性細菌進行形態特征、理化特征、VITEK 2 ZOMPACT 30自動微生物鑒定系統鑒定、結合16S rDNA序列的分子鑒定，并構建系統發育樹；進行人工感染試驗及藥物敏感性試驗。結果分離到1株優勢菌，根據此株分離菌的形態特征、理化特征、自動微生物鑒定系統鑒定、結合16S rDNA序列測定與系統發育樹分析結果，判定其為氣單胞菌屬的維氏氣單胞菌。此菌對供試健康黃喉擬水龜和小鼠有較強的致病作用，對供試20種抗菌藥物中的頭孢吡肟、阿米卡星、氧氟沙星、米諾環素高度敏感；對洛美沙星、恩諾沙星、氯霉素等3種中度敏感；對頭孢噻吩、環丙沙星等13種表現耐藥。表明所檢出的維氏氣單胞菌，是導致黃喉擬水龜以出血和腹水為主要病理特征的致病菌。

關鍵詞：維氏氣單胞菌；鑒定；藥敏；黃喉擬水龜

黃喉擬水龜（Mauremys mutica）為龜科擬水龜屬的爬行動物。由于黃喉擬水龜具有較高的經濟價值，近年來人工集約化養殖蓬勃發展，隨之而來的疾病也越來越嚴重，這給養殖者帶來比較大的經濟損失。2014年8月，廣西憑祥市某養殖戶8年龜發病，以急性腹瀉為特征性癥狀，患病動物以出血和腹水為主要病理特征，發病率30%，死亡率20%，對病死龜進行病理剖檢和病原分離，對分離到的菌株采用細菌表型特征、生化試驗以及VITEK 2 ZOMPACT 30自動微生物鑒定系統對分離菌株進行了鑒定，并進行了藥敏試驗，證明黃喉擬水龜所患疾病是由維氏氣單胞菌引起。

1　材料與方法

1.1材料患病龜來源于廣西憑祥市某養殖戶。健康黃喉擬水龜6只，購自另一養殖戶，每只體重約20 g。健康小鼠18只，購自廣西醫科大學實驗動物中心，每只體重20 g。

血液瓊脂平板，購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司；藥敏試紙、細菌生化微量鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；VITEK 2 ZOMPACT 30自動微生物鑒定系統為法國梅里埃公司產品；營養肉湯、麥康凱瓊脂培養基，購自北京陸橋技術有限責任公司。PCR擴增和測序試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2方法

1.2.1細菌分離培養與純化洗凈病龜的外殼，體表用75%乙醇消毒后，無菌操作采集黃喉擬水龜的肝、腎、心血于血平板和麥康凱培養基上，28℃培養18～24 h，選取形態均一的優勢菌群，挑取單菌落反復劃線純化3次，純化所得菌株4℃保存。

1.2.2細菌生物學鑒定

1.2.2.1形態觀察將保存菌株劃線接種于營養瓊脂平板上，28℃培養，觀察菌落形態，挑取單個菌落進行革蘭染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態。

1.2.2.2生化鑒定分離菌理化特性鑒定參照《水生微生物學實驗法》和《一般細菌常用鑒定方法》、《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》鑒定到種。

1.2.2.3分離菌用VITEK 2 ZOMPACT 30自動微生物鑒定系統鑒定取純化培養的單菌落接種營養瓊脂平板培養18～24 h，然后收集細菌。制備菌懸液，用0.45%NaCl溶液，制成0.5～0.63麥氏單位，pH值5.5～7.2的菌懸液。選取革蘭陰性桿菌鑒定卡。28℃培養24 h，儀器自動分析并給予鑒定結果。

1.2.2.4分子生物學鑒定取1 mL培養好的菌液，按照革蘭陰性菌提取試劑盒提取總DNA。使用25 μL反應體系，使用DreamTaq Green PCR Master Mix （2×）（Thermo Scientific）試劑盒進行PCR擴增：DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）12.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，加水定容至25 μL。擴增條件：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸9O s，35個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后將陽性樣品送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序。所得序列采用Blastn程序進行同源性檢索，采用ClustalX軟件進行多序列全局比對，利用MEGA6.O軟件，選用Neighbour—Joining方法，自舉1000次構建系統發育樹。

1.2.3動物感染試驗取純化的菌株接種于營養肉湯中，28℃培養18 h。取1 mL作倍比稀釋用傾注平板法測定每毫升中的細菌數，其余于4℃下保存。次日用無菌生理鹽水將上述菌液稀釋成4.0×10 CFU/ mL的細菌懸液，用于動物感染試驗。

將6只健康黃喉擬水龜飼養7 d，隨機分為2組：試驗組4只，對照組2只。試驗組，后腿肌肉注射0.3 mL菌液。對照組，后腿肌肉注射無菌生理鹽水0.5 mL。均置于水溫28℃、pH值7.2環境下飼養，從死亡龜中分離致病菌，并鑒定。

小鼠隨機分成3組，每組6只。第1組小鼠肌肉注射菌液0.1 mL/只，第2組小鼠肌肉注射菌液0.2 mL/只，第3組做對照組，注射無菌生理鹽水0.5 mL，28℃隔離飼養觀察，并及時記錄小鼠的發病和死亡情況，對死亡小鼠進行細菌分離和鑒定。

1.2.4藥物敏感性試驗采用標準Kirby -Bauer紙片擴散法對分離菌株進行常用的頭孢吡肟、環丙沙星等20種抗生素藥物的敏感性檢測，28℃培養24 h后，測定抑制圈直徑大小。

2　結果

2.1分離菌培養結果從患病黃擬水龜中分離純化培養得到形態均一的細菌。該菌在麥康凱培養基上生長良好，菌落表面光滑濕潤、圓形、隆起、邊緣整齊、乳白色。營養瓊脂上有灰白色、半透明濕潤菌落生長。在血平板上，可觀察到圓形、中央稍隆起、灰白色、明顯β溶血的菌落。革蘭染色鏡檢，該菌為革蘭陰性桿菌，菌體呈兩端鈍圓，多單個或成雙。

2.2生化鑒定結果菌株具有動力性；不發酵木糖、肌醇、衛矛醇、鼠李糖等；利用葡萄糖、棉子糖等；賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、氧化酶陽性；精氨酸雙水解酶；其他生化結果見表1，參照《常見細菌系統鑒定手冊》和布坎南等編的《伯杰細菌鑒定手冊》，分離菌株的主要生化特征與維氏氣單胞菌特性基本一致，初步鑒定分離菌株為維氏氣單胞菌（A.veronii）。

表1　菌株生化特征

2.3VITEK 2 ZOMPACT 30自動微生物鑒定系統鑒定結果經用VITEK 2 ZOMPACT 30自動微生物鑒定系統鑒定，分離菌為維氏氣單胞菌（A.veronii）。

2.4分子生物學鑒定結果以菌株的DNA為模板，擴增引物：正向引物16Sf：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3′，反向引物16Sr：5′-aaggaggtgatccagaa-3′，進行PCR擴增，電泳顯示擴增出大小約1 500 bp的特異性條帶，結果見圖1。經由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，得到實為1450bp大小的PCR產物片段，將序列進行Blastn比對分析發現，16S rRNA分別與GenBank數據庫中公布的維氏氣單胞茵（A.veronii）不同菌株16S rRNA基因序列同源性高達99%。選取25個氣單胞菌屬細菌16S rRNA序列，以及5個弧菌屬（Vibrio）細菌16S rRNA序列作為外群，運用ClustalX2.0，MEGA6.0構建系統進化樹，結果見圖2。分離菌株與A.veronii菌株HSCC（GenBank登錄號：KJ749842.1）聚為一簇。

2.5動物感染試驗結果經過人工回歸感染試驗發現，分離菌株對黃喉擬水龜具有高致病性，接種后，癥狀與自然發病癥狀基本一致，對照組未見任何異樣。從死亡龜和小鼠體內分離到與接種完全相同的細菌。

2.6藥物敏感性試驗結果分離菌對頭孢吡肟、阿米卡星、氧氟沙星、米諾環素敏感；對洛美沙星、恩諾沙星、氯霉素中度敏感；對頭孢噻吩、環丙沙星、諾氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、克林霉素、四環素、紅霉素、青霉素、復方新諾明、桿菌肽、阿莫西林表現耐藥。

圖1　菌株l6S rRNA基因擴增結果：M：Marker；泳道1：菌株擴增產物；泳道2：陰性對照（以水為模板）

圖2　分離菌株與氣單胞菌屬細菌16S rRNA所構建的系統發育樹||內為Genbank序列登錄號

3　討論

本試驗從發病黃喉擬水龜體內分離的菌株對健康黃喉擬水龜表現出較強的致病力，且回歸感染發病癥狀與自然發病龜的癥狀相似，對照組不發病，證實分離菌株為該病的病原菌。根據生理生化鑒定結果，發現該菌與維氏氣單胞菌的生化標準基本一致，應用VITEK 2 ZOMPACT 30自動微生物鑒定系統鑒定，系統鑒定此菌為維氏氣單胞菌，進一步采用16 S rRNA基因進行鑒定，16S rRNA分別與GenBank數據庫中公布的維氏氣單胞茵（A.veronii）不同菌株16S rRNA基因序列同源性高達99%，且系統分析顯示，分離菌株與維氏氣單胞菌在進化樹上聚為一簇，結合病原菌的形態學特征進一步鑒定該菌為維氏氣單胞菌。

維氏氣單胞菌廣泛存在于水體、污泥、土壤中，可產生一系列的毒力因子，如氣溶素、腸毒素和粘附因子等[5]，這些毒力因子在水產動物、人類甚至畜禽感染中起著舉足輕重的作用，可引起斑點叉尾鮰、大鯢、錦鯉、鯰魚、中華絨螯蟹等大量死亡[2-4]。此外，該菌能感染人類，引起急性腹瀉、菌血癥、腦膜炎和心內膜炎等病癥，是一種致病性強的新型人-魚共患致病菌[5]，并在食品安全上表現出重要意義。本研究從患病的黃喉擬水龜分離到一株維氏氣單胞菌，經人工回歸試驗顯示出較強的致病性，進一步揭示了該菌在水產養殖動物中的病原性意義。使用藥物防治此病，既要考慮細菌對藥物的敏感性，也要遵守水產用藥規定。

參考文獻：

[1]吳同壘，單曉楓，孟慶峰，等.維氏氣單胞菌研究進展[J].中國獸藥雜志，2011，45（7）：41-44.

[2]黃小麗，吳春艷，鄧永強，等.斑點叉尾鮰維氏氣單胞菌病的病理組織學觀察[J].中國獸醫科學，2010，40（7）：738-742.

[3]王旭，顏其貴，陳玥，等.中國大鯢維氏氣單胞菌病的組織病理學觀察[J].中國獸醫科學，201l，41（7）：737-740.

[4]秦國民，張曉君，陳翠珍，等.錦鯉維氏氣單胞菌感染癥及其病原生物學特性研究[J] .安徽農業科學，2008，36（19）：8115-8117.

[5] Wu C J，Wu J J，Yan J J，et al.Clinical significance and distribution of putative virulence markers of 116 consecutive clinical Aeromonas isolates in southern Taiwan[J].Journal of Infection，2007，54（2）：151-158.

作者簡介：何成偉（1969-），男，高級獸醫師，碩士，從事動物疫病檢疫工作，E-mail：hcw321@sina.com

收稿日期：2014-12-17

中圖分類號：S947.9

文獻標志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0106- 03