基于宏基因組學的成年和老年袋鼠腸道菌群多樣性和差異性研究

高云航，徐佳萍，趙晗旭，邸海洋，王　巍，婁玉杰，馬紅霞（.吉林農業大學動物科技學院，吉林長春08；.中國農業科學院特產研究所，吉林長春0；.長春動植物公園，吉林長春006）

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基于宏基因組學的成年和老年袋鼠腸道菌群多樣性和差異性研究

高云航1，徐佳萍2，趙晗旭1，邸海洋3，王巍1，婁玉杰1，馬紅霞1
（1.吉林農業大學動物科技學院，吉林長春130118；2.中國農業科學院特產研究所，吉林長春130112；3.長春動植物公園，吉林長春130062）

摘要：為了了解袋鼠糞便中菌群的多樣性，分析成年和老年袋鼠糞便中菌群的差異性。應用高通量測序技術測定成年和老年袋鼠糞便細菌16S rDNA的V3-V4變異區序列，應用Prinseq和Mothur等軟件整理和統計樣品序列數目和操作分類單元（OTUs）數量，分析菌群物種豐度、分布和Alpha多樣性。獲得成年袋鼠糞便（AK）的OTU數為7 210，老年袋鼠糞便（OK）的OTU數為6 120。AK和OK的豐富度指數分別為4 377.028/7301.574和1 430.718/1858.623，香農指數分別為6.275和4.273。AK和OK腸道優勢菌群均隸屬厚壁菌門，分別占65%（AK）和78%（OK），除此之外，共有優勢菌門還有變形菌門、擬桿菌門和螺旋菌門，但AK有四種獨有菌門。獲得了成年和老年袋鼠糞便中細菌的豐富度、菌群結構及差異性。

關鍵詞：袋鼠；腸道菌群；宏基因組學

袋鼠是典型的草食動物，是研究哺乳動物較好的動物比較模型。袋鼠前腸具有獨特的消化功能，可進行高效能量轉換，被廣泛認為是低甲烷排放動物[1]。由于影響袋鼠的疾病主要為口腔疾病和消化道疾病[2]，因此，開展不同年齡袋鼠糞便中細菌多樣性的研究和菌群結構的分析可為深入研究單胃食草野生動物消化道菌群提供理論基礎，進而為減緩動物老齡化以及動物消化道疾病的防控提供新思路。宏基因組學作為新興的分子生物學技術，適用于開展微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性以及其相互關系等相關研究[3]。本研究采用高通量測序技術對成年和老年袋鼠糞便進行細菌宏基因組分析，探明不同年齡袋鼠腸道細菌的物種豐富度和差異性，為進一步探討野生動物的消化機制積累數據。

1　試驗材料

袋鼠糞便：長春市動植物公園連續10 d采集4只成年健康袋鼠和4只老年健康袋鼠的新鮮糞便，-80℃保存備用。

2　試驗方法

2.1袋鼠糞便總DNA提取提取成年與老年袋鼠糞便總DNA。成年袋鼠組（AK）與老年袋鼠組（OK）采集的糞便中隨機采取每組各8g樣品，分別加入25 mL PBS，反復低速離心去除雜質直至上清澄清，再將上清高速離心得到沉淀，預處理后采用CTAB法提取總DNA。

2.216S rDNA的擴增利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒定量總DNA，PCR引物為已融合Miseq測序平臺的V3-V4通用引物。PCR擴增反應體系見表1，對PCR產物進行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒回收DNA。回收產物用Qubit2.0定量，根據測得的DNA濃度，將樣品按照比例進行混合，混合后充分震蕩均勻，用于后續樣品建庫與測序。

表1　PCR反應體系

2.3生物信息學分析數據預處理后，采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過各樣品barcode使數據回歸樣品，并對各樣本序列做QC。然后去除非靶區域序列及嵌合體，采用RDP classifier將序列進行物種分類，根據序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU）。最后計算各種物種多樣性指數，衡量樣本物種多樣性。

3　結果

3.1袋鼠腸道細菌宏基因組DNA提取結果分別提取成年袋鼠（AK）和老年袋鼠（OK）糞便細菌基因組DNA，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功提取出目的DNA。利用Nanodrop 2000分光光度計測得DNA濃度與純度均符合宏基因組測序的基本要求（表2）。

表2　袋鼠腸道細菌宏基因組DNA質量檢測結果

3.2細菌16S rDNA V3-V4區片段的PCR擴增結果以提取的袋鼠糞便微生物總DNA為模板進行細菌16S rDNA V3-V4區片段的PCR擴增，切膠回收后，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功擴增出大小為230 bp左右的目的片段。

3.3袋鼠腸道菌群多樣性分析結果兩個樣品獲得最終用于分析的序列條數、OUT數目、香農指數、Ace指數、Chao1指數樣品覆蓋率見表3，前插彩版圖1為香農指數和豐富度稀疏分析圖。

表3　各樣品相關參數

3.4袋鼠腸道菌群差異性分析對單個樣品中的OUT在門和屬水平進行歸類和整理。在門水平，AK腸道細菌隸屬于11個門，厚壁菌門（Firmicutes）占比例最大（占65%），與OK組相比，特有的菌門為互養菌門（Synergistetes）、軟壁菌門（Tenericectes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和廣古菌門（Euryarchaeota）。OK腸道細菌隸屬于7個門，厚壁菌門所占比例仍為最大（78%），其余的3個門僅占1%，前插彩版圖2。

在屬水平，AK腸道細菌隸屬于92個屬，豐度≥2%的屬為瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）、RC9、普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae）、擬桿菌屬（Bacteroides）、dgA- 11、hoa5-07d05、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio），其余84個屬占19%。OK腸道細菌隸屬于80個屬，豐度≥2%的屬為瘤胃球菌屬、鏈球菌屬（Streptococcus）、Barnesiella、普氏菌屬（Prevotella）、密螺旋體屬（Treponema），其余75個屬占20%，前插彩版圖3。

4　討論

本研究采用高通量測序獲得的袋鼠糞便中細菌豐度最高的為厚壁菌門，其次是擬桿菌門，因此這些微生物可能在纖維物質消化中起主要作用。李志鵬等[4]利用16S rRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃細菌多樣性，結果為梅花鹿瘤胃中87.9% 的16S rRNA基因序列與普雷沃氏菌屬相似，Nelson等[5]研究報道了奶牛瘤胃及羚羊、斑馬腸道內主要菌群，反芻動物瘤胃內最主要菌群為擬桿菌門的普雷沃氏菌，而非反芻動物腸道主要菌群為厚壁菌門的瘤胃球菌和梭菌。袋鼠為單胃草食動物，本研究中袋鼠糞便中微生物瘤胃球菌屬與梭菌屬為主，二者是產乙酸菌，利用氫氣產生乙酸而不是甲烷，這有可能是單胃草食動物排放甲烷量低于反芻動物的原因。

本試驗主要對比分析成年袋鼠與老年袋鼠糞便中菌群的差異，結果表明，年齡對袋鼠腸道菌群多樣性及優勢菌群的結構有一定影響。這與一些報道結果相一致[6-7]。在門水平，軟壁菌門和疣微菌門是成年袋鼠糞便中所特有的，疣微菌門是一門被劃出不久的菌門，主要存在土壤和人類糞便中，該類細菌有很大的研究空間。在屬水平，除瘤胃球菌屬為二者最主要優勢菌群外，成年袋鼠糞便菌群中優勢菌群為普雷沃氏菌屬和毛螺旋菌屬，而老年袋鼠組優勢菌屬為丁酸弧菌屬、密螺旋體屬和鏈球菌屬，普雷沃氏菌是纖維降解菌，能產生一系列的木聚糖酶；丁酸弧菌是一類高效木聚糖降解菌；密螺旋體屬和鏈球菌屬可能是袋鼠老齡化產物，甚至有可能影響袋鼠的健康狀態，這為進一步研究動物消化道調節機制提供依據。

由于高通量測序技術成本高以及野生動物樣本采集存在一定困難，至今基于該技術對野生動物腸道菌群多樣性的相關研究不多[8]，隨著科研的不斷深入，愈來愈多的野生動物不同生理時期的腸道菌群將得以揭示，為進一步探討腸道菌群的作用機制提供參考數據。

參考文獻：

[1] Mark Morrison . Looking large，to make more，out of gut metagenomics[J].Current Opinion in Microbiology，2013，16：630-635.

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[3] Rondon M R，August P R，Bettermann A D，et al . Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms[J] .Appl Environ Microbiol，2000，66（6）：2541-2547.

[4]李志鵬，劉晗璐，崔學哲，等.基于16S rRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃細菌多樣性[J].動物營養學報，2013，25（9）：2044-2050.

[5] Nelson K E，Zinder S H，Hance I，et al.Phylogenetic analysis of the microbial populations in the wild herbivoregastrointestinal tract：instights into an unexplored niche[J] . Environmental Microbiology，2003，5（11）：1212-1220.

[6] Benson A K，Kelly S A，Legge R，et al.Individuality in gut micobiota composition is a complex polygenic trait shaped by multiple environmental and host genetic factors[J] . PNAS，2010，107：18933-18938.

[7] Wu S T，Baldwin R L，Li W Z，et al . The Bacterial Community Composition of the Bovine Rumen Detected Using Pyrosequencing of 16S rRNA Genes[J].PNAS，2012，1：1-11.

[8] Brulc J M，Antonopoulos D A，Miller M E B，et al.Gene-centric metagenomics of the fiber adherent bovine rumen microbiome reveals forage specific glycoside hydrolases[J] . PNAS，2009，106：1948-1953.

第25屆世界家禽大會（WPC2016）暨中國畜牧獸醫學會2016年學術年會征文通知

第25屆世界家禽大會（WPC2016）暨中國畜牧獸醫學會2016年學術年會將于2016年9月5日－9日在北京國家會議中心召開，屆時中國畜牧獸醫學會禽病學分會第十八次學術研討會同期舉行。本次大會由中國畜牧獸醫學會主辦，中國畜牧獸醫學會家禽學分會、禽病學分會和北京博亞和訊農牧技術有限公司協辦。

大會征文即日開始，誠邀畜牧獸醫相關學科領域的科技工作者積極投稿，本屆年會將繼續評選優秀論文，頒發我國畜牧獸醫學術界的最高榮譽-“中國畜牧獸醫學會獎”及相關分會的優秀論文獎。大會誠摯邀請國內外家禽行業從業者參加本次大會，就行業內的熱點問題與最新的科技和產業進展展開充分的交流、討論，尋找更多的合作機會，共同促進家禽行業可持續發展。

1會議地點國家會議中心（北京市朝陽區天辰東路7號）

2會議征文的具體要求

本次會議分中英文征文，英文論文摘要將進入世界家禽大會論文集，中文論文摘要將進入中國畜牧獸醫學會2016年學術年會論文集。兩個會議征文具體要求：

大會將圍繞“家禽產品的質量與安全：滿足人類需要”主題，研討和交流新理論和新技術。請進入會議網站http:// www.wpc2016.cn/zh/，點擊摘要選擇WPC摘要（投英文摘要入口）、年會摘要（投中文摘要入口）進入會議投稿系統。具體步驟請參看網站上的使用說明。；英文摘要截止日期為2016年2月5日，中文論文截止日期為2016年6月30日。

2016年年會將繼續在投稿的在讀研究生中挑選100名免費參加會議（免住宿、注冊費），具體申請條件請見會議網站。免費參會學生申請材料郵寄地址：北京市朝陽區農展館南路9號博雅園1-106（100125）。聯系人：申凌、石娟，電話：010-85959006 85959010。E-mail：caav2007@163.com

3會議中文網站http://www.wpc2016.cn/zh/

4聯系方式1. WPC2016征文（英文）咨詢：連玲010-62731256 llian@cau.edu.cn，鄭江霞010-62732741 info@wpc2016.cn。2.學術年會征文（中文）、免費參會學生、中賓參會咨詢：（1）年會征文咨詢：石娟010-85959010 caav001@163.com，（2）免費參會研究生咨詢：申凌010-85959006 caav2007@163.com，（3）中賓參會咨詢：劉海霞010-85959010 caav123@126.com。3.贊助、媒體參會咨詢：王必勇010-82893959 meeting@boyar.cn。4.會員入會咨詢：（1）家禽學分會：竇新紅0514-85599035 jqxfhmsc@163.com。（2）禽病學分會：姚煒光010-51503677 qbxfhywg@126.com。5.團體會員單位參會咨詢：顏海燕010-62125896，張高霞010-62125686，郭自干010-62110970，張保密010-62126106。6.住宿咨詢及外賓參會咨詢：代旭010-58166463 daixu@cytsmice.com

Study on intestinal flora in theadult and elderly kangaroos by themetagenomics

GAO Yun-hang1，XU Jia-ping2，ZHAO Han-xu1，DI Hai-yang3，WANG Wei1，LOU Yu-jie1，MA Hong-xia1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，China；2.Institute of special animal and plant sciences of caas，Changchun 130112，China；3.Changchun Zoological Botanical Park，Changchun 130062，China）

Abstract：To study the diversity of bacterial flora in kangaroo feces and analyze the differences between bacterial floras in adult kangaroo feces and in elderly kangaroo，we used high-throughput sequencing to measure the V3-V4 sequences of 16S rDNA in adult and aged kangaroo feces，use Prinseq and Mothur to settle and count the amounts of sample sequences and OTUs，and analyze the abundance of bacterial species，locations and Alpha diversity . Our study got 7 210 OTUs of adult kangaroo feces，and for elderly kangaroo feces，the numbers of OTUs were 6120.The abundance indexes of adult and elderly kangaroos were 4377.028/7301.574 and 1430.718/1858.623，and the shannon indexs were 6.275 and 4.273 for adult and aged kangaroos，respectively.The dominant bacterial flora of both kangaroos belongs to Firmicutes，and they occupied 65%（AK）and 78%（OK）respectively.In addition，common dominant Eumycotas were Proteobacteria，Bacteroidetes and Spirochaetae . However，there were four unique Eumycotas in adult kangaroo feces . In conclusion，we got the abundances，bacterial structures and differences from adult and elderly kangaroos.

Key words：kangaroo；intestinal flora；metagenomics

Corresponding author：MA Hong-xia

通訊作者：馬紅霞，E-mail：hongxia0731001@163.com

作者簡介：高云航（1975-），男，副教授，博士，研究方向為動物微生態學，E-mail：gaoyunhang@163.com

基金項目：國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-38）；國家自然科學基金項目（31372331）；吉林省教育廳科學技術研究項目（201358）；吉林省青年科研基金項目（20130522092JH）

收稿日期：2014-05-25

中圖分類號：Q969.33+1.2

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0103- 02