犬子宮內膜上皮細胞和基質細胞的分離培養與鑒定

宗振平，朱　琪，錢婉瑩，鐘友剛，許劍琴，劉鳳華（.中國農業大學動物醫學院，北京海淀0093；.北京農學院動物科學技術學院，北京昌平006）

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犬子宮內膜上皮細胞和基質細胞的分離培養與鑒定

宗振平1，朱琪1，錢婉瑩1，鐘友剛1，許劍琴1，劉鳳華2
（1.中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193；2.北京農學院動物科學技術學院，北京昌平102206）

摘要：為了探究犬子宮內膜細胞的培養方法，采用組織塊培養法和酶消化培養法進行細胞培養并使用倒置顯微鏡觀察細胞的形態結構和生長狀態，對細胞進行免疫組化鑒定。結果表明，組織塊培養法需要1周左右培養出犬子宮內膜上皮細胞，且細胞不易純化；酶消化培養法節省時間，獲得的細胞活力強、純度高。綜上所述酶消化培養法更適于培養犬子宮內膜細胞，為后期細胞水平研究奠定基礎。

關鍵詞：犬；子宮內膜細胞；組織塊培養法；酶消化培養法

1　材料與方法

1.1子宮來源子宮由中國農業大學動物醫院提供，為正常犬進行子宮與卵巢切除術（OHE）后的子宮，子宮內膜生長階段為間情期。

1.2主要試劑和儀器DMEM/F12（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；EDTA-胰蛋白（GIBCO）；Ⅰ型膠原酶（GIBCO）；PBS（GIBCO）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；倒置相差顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）；CO2細胞培養箱（香港力康生物醫療科技控股集團）；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）。

1.3方法

1.3.1子宮取樣使用保溫桶加入200 mL的生理鹽水（含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）將做完子宮與卵巢切除術（OHE）的子宮帶回實驗室。在無菌環境下，首先將子宮周圍的其余組織剪除，然后使用加入雙抗的生理鹽水對子宮進行沖洗。子宮外部沖洗干凈后，使用手術剪在子宮角與卵巢的交界剪1個小孔，使用注射器抽取加入雙抗的生理鹽水對子宮內部進行沖洗。

1.3.2組織塊培養法在超凈工作臺中，準備好加入雙抗的生理鹽水、玻璃平皿、5 mL玻璃瓶、15 mL離心管，在玻璃平皿和玻璃瓶中加入雙抗生理鹽水。子宮沖洗完畢后放入到加雙抗生理鹽水的玻璃平皿中，將子宮角剪開，使用手術剪將子宮內膜從肌層上分離下來放入小玻璃瓶中，然后將組織塊剪碎到體積大約為1 mm3（分離的組織塊內血細胞含量較多時，剪碎前使用生理鹽水沖洗2～3次）。組織塊被剪碎后使用加入雙抗的生理鹽水沖洗干凈，沖洗完畢后使用移液槍將組織塊移入到15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，離心后使用PBS沖洗2～3次。使用PBS沖洗完畢后，在離心管中加入3～4倍組織塊體積的3%胰酶37℃水浴1 min，然后1 000 r/min離心5 min。丟棄上清液，根據組織的量，加入少量培養基混勻（培養基的量盡可能的少）。將混勻的組織塊分裝到細胞瓶中鋪勻，組織塊密度大約為5塊/cm3。組織塊分布均勻后，將細胞瓶倒置放入CO2培養箱中4 h促進組織塊貼壁，4 h后將細胞瓶慢慢翻轉過來靜置培養。24 h后進行補液，加入1.5 mL培養基繼續培養。以后每天觀察組織塊的生長狀態，每2 d換液1次，每次加入3 mL培養基。

1.3.3酶消化培養法酶消化法的前期組織塊處理同組織塊法，使用PBS沖洗完后在離心管內加入3～4倍體積的5%的Ⅰ型膠原酶，37℃水浴50 min。進行水浴時離心管要全部浸入水中，每隔10 min震蕩混勻1次。水浴完畢后，加入PBS對消化液進行稀釋（便于進行過濾）。首先使用80目的過濾網對稀釋后的消化液進行過濾（該過程主要將消化后的肌肉組織與細胞分離），然后使用300目的細胞篩對第一次過濾后的細胞懸液進行過濾（該過程主要將上皮細胞團及上皮細胞和基質細胞分離），使用300目的濾網進行過濾后上皮細胞團及單個上皮細胞則保留在濾網上方，使用PBS對濾網上保留的細胞團和細胞進行沖洗，沖洗后使用移液槍將沖洗液移入離心管中，1 000 r/min離心5 min，丟棄上清后的沉淀即為上皮細胞團和單個上皮細胞。根據細胞量使用培養基將細胞稀釋到2×105個/mL，然后將細胞懸液移入細胞培養瓶中，做好標記放入CO2培養箱中靜置培養。300目濾網過濾后的細胞液中主要為基質細胞，將細胞液移入離心管中，1 500 r/min離心10 min，沉淀即為基質細胞。使用培養基將基質細胞濃度稀釋到5×105個/mL，然后將細胞懸液移入細胞培養瓶中，做好標記放入CO2培養箱中靜置培養。

1.3.4H.E.染色鏡下觀察細胞爬片，細胞貼壁生長完畢后取出進行H.E.染色。首先使用PBS沖洗載玻片2次，每次1 min；使用4%多聚甲醛進行固定20 min，PBS漂洗兩次，每次1 min；使用蘇木精染色10 min，自來水洗滌；鏡下觀察細胞核染色，如染色多深則使用1%鹽酸酒精分色數秒，自來水洗滌；使用伊紅染液染色3 min，自來水洗滌；染色完畢后將載玻片晾干，使用中性樹膠封片。

1.3.5免疫組化鑒定將無菌蓋玻片置于六孔板中，將調節好的細胞懸液滴加在蓋玻片上進行培養。顯微鏡下觀察，待細胞長滿后，取出蓋玻片，用90%乙醇固定10 min，PBS漂洗。上皮細胞使用犬特異性的角蛋白抗體按照操作進行染色，基質細胞使用犬特異性的波形蛋白抗體按照操作進行染色。使用PBS做陰性對照組進行染色，光學顯微鏡下觀察染色結果。

習近平總書記指出：“只有堅持愛國和愛黨、愛社會主義相統一，愛國主義才是鮮活的、真實的，這是當代中國愛國主義精神最重要的體現。”[注]習近平：《習近平在中共中央政治局第二十九次集體學習時強調：大力弘揚愛國主義精神 為實現中國夢提供精神支柱》，《人民日報》2015年12月31日，第1版。愛國主義是一個歷史范疇，愛國主義和熱愛中國共產黨、熱愛社會主義制度、熱愛中國特色社會主義相統一、相一致，是由沒有共產黨就沒有新中國、只有社會主義才能救中國、只有中國特色社會主義才能發展中國、只有中國共產黨才能帶領中華民族實現偉大復興中國夢的歷史事實和現實邏輯所決定的。

2　結果

2.1組織塊法原代培養細胞體外生長方式和形態特征

2.1.1基質細胞組織塊法培養的基質細胞在組織塊貼壁后24 h內即向外游離，細胞絕大部分為單個向外游離。在游離初期細胞呈梭形，游離細胞相互連接后細胞增殖生長呈束為多邊形。

2.1.2上皮細胞組織塊培養法中上皮細胞大約在7 d左右開始向外游離。如圖1所示，上皮細胞呈梭形沿組織塊呈圓環形向外生長，以細胞團的方式存在，細胞之間緊密連接，胞質透明，細胞核輪廓清晰，核仁明顯。

2.2酶消化法原代培養細胞體外生長方式和形態特征

2.2.1基質細胞圖2為接種24 h后的基質細胞，可見細胞單個生長呈梭形。酶消化法接種的基質細胞在培養4 h后貼壁，24 h后處于增殖狀態，48 h后基質細胞體積變為原來的2～3倍，連接成片，細胞間連接緊密，呈漩渦狀。

圖1　組織塊培養法中向外游離的上皮細胞（4×10）

圖2　酶消化法接種24 h后的基質細胞A：4×10鏡下的基質細胞；B：4×20鏡下的基質細胞

2.2.2上皮細胞圖3為培養24 h后的上皮細胞，可見上皮細胞連接緊密，輪廓清晰，形態呈梭形。上皮細胞在培養8 h后貼壁，24 h后開始增殖，上皮細胞連接成片后細胞形態依然保持梭形，細胞間連接緊密。48 h后上皮細胞仍保持梭形，有一部分已經細胞衰老。

圖3　酶消化法接種24 h后的上皮細胞A：4×10鏡下的上皮細胞；B：4×20鏡下的上皮細胞

2.3H.E.染色

2.3.1基質細胞如前插彩版圖4-A、B所示H.E.染色后基質細胞的形態更加明顯，基質細胞核呈藍色，細胞質呈紫色。細胞形態為多邊形，輪廓更加明顯。

2.3.2上皮細胞如前插彩版圖5 -A、B所示H.E.染色后可見上皮細胞延組織塊向外擴散生長，細胞與細胞間連接緊密，長成一片。細胞核為藍色，細胞質為紫色。細胞形態結構明顯，細胞間連接染色后也更加明顯。

2.4免疫組化細胞鑒定試驗

2.4.1基質細胞如中插彩版圖6所示，使用犬特異性波形蛋白抗體進行免疫組化試驗后鏡下觀察基質細胞細胞質呈棕黃色，PBS陰性對照組基質細胞不著色。使用蘇木精染液復染后，鏡下觀察基質細胞細胞核呈藍色。

2.4.2上皮細胞如中插彩版圖7所示，使用犬特異性角蛋白抗體進行免疫組化試驗后鏡下觀察上皮細胞細胞質呈棕黃色，PBS陰性對照組上皮細胞不著色。使用蘇木精染液復染后，鏡下觀察基質細胞細胞核呈藍色。

3　討論

人子宮內膜細胞培養中Akoum A等研究中采用Matthews C J的方法將組織剪碎，使用Ⅰ型膠原酶進行孵育消化，通過2 000 r/min離心10 min將腺細胞和基質細胞分離[1-2]，Tuckerman E等研究中將收集的人子宮內膜剪成1～3 mm3大小，使用0.2%Ⅰ型膠原酶進行37℃水浴1 h，每30 min進行吹打1次，使消化下來的細胞分散開，經過1 000 r/min離心5 min獲得腺上皮細胞，剩下的組織同樣條件繼續進行消化1 h，然后離心分離獲得顆粒型上皮細胞[3]。國內研究中戈一峰等研究中使用1.25%Ⅰ型膠原酶進行37℃水浴1.5 h，先用80目篩網初篩，然后用300目復篩，基質細胞通過細胞篩，而上皮細胞留在篩網上，使用PBS沖洗篩網即可獲得上皮細胞，過網的濾液則通過離心獲取基質細胞[4]。秦莉花等使用加入EDTA 的0.25%胰酶、0.1%膠原酶和0.1%透明質酸混合體積為剪碎組織的3倍進行消化，每20 min終止消化1次，取上清液，加入配好的培養基終止培養，剩余部分按同樣條件繼續消化，共消化6次，消化完畢經過處理即獲得子宮內膜上皮細胞和基質細胞[5]。陳曉嵐等使用1.25%Ⅰ型膠原酶消化剪碎組織1.5 h，使用80目和300目細胞篩進行初篩和復篩，基質細胞進行500 r/min離心10 min，然后沖洗干凈進行培養，篩網上的上皮細胞被沖洗下來，沉淀后培養[6]。人的子宮內膜細胞培養大部分使用Ⅰ型膠原酶的方法進行消化，處理方式大致相同。

目前國內對于奶牛、綿羊、兔和小鼠的子宮內膜細胞培養均有研究[7-11]，張雷等分別使用組織塊法和酶消化法進行奶牛子宮內膜上皮細胞的培養，組織塊法是將組織剪碎后直接加入培養基進行倒置培養，2～4 h后翻轉培養瓶進行培養，酶消化法先使用0.3%胰蛋白酶進行37℃水浴40 min，吸取懸液使用雙層紗布過濾，未消化的組織塊使用PBS沖洗，獲得上皮細胞懸液，剩余的組織塊使用0.1%Ⅱ型膠原酶進行37℃水浴2 h，將第1次和第2次的消化液合并，加入培養基終止消化，1 000 r/min離心10 min，獲得的細胞使用培養基進行稀釋培養[8-9]。

國外Kovacs G.等使用酶消化法進行犬子宮內膜細胞培養，使用1%Ⅰ型膠原酶進行37℃水浴2～3 h，然后先使用250 μm的細胞篩除去肌肉組織和未消化完全的組織，然后使濾液通過40 μm的細胞篩，通過兩次篩濾獲得犬子宮內膜基質細胞和上皮細胞[12]。國內目前沒有犬子宮內膜細胞培養的相關研究，本試驗中培養條件是根據人和各種動物的研究進行摸索得出。在細胞培養過程中細胞密度的調整非常關鍵，細胞懸液密度一般為2×105/mL。密度過低細胞不易建立細胞連接，細胞不易進行增殖；密度過高細胞生長過密，容易導致細胞活性降低。在細胞生長過程中要注意掌握犬子宮內膜基質細胞和上皮細胞的生長周期，基質細胞在24 h內增殖較快，細胞保持梭形狀態。本試驗使用組織塊法和酶消化法兩種方法進行犬子宮內膜細胞培養，其中酶消化法節省時間，獲得的細胞活性、細胞純度較高，適于培養犬子宮內膜細胞。

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Isolation，Cultureand Identification of Canine Endometrial Epithelial Cells and Stromal Cells

ZONG Zhen-ping1，ZHU Qi1，QIAN Wan-ying1，ZHONG You-gang1，XU Jian-qin1，LIU Feng-hua2
（1.College of veterinary medicine，China Agriculture University，Beijing 100193，China；2.Animal science and technology college，Beijing Univercity of Agriculture，Beijing 102206，China）

Abstract：To study the methods for culturing canine endometrial cells，tissue block culture method and enzymatic digestion culture method were used in this study . Cells were identified by immunohistochemical staining，the morphological structure and growth status of endometrial epithelium cells were observed by inverted phase-contrast microscope .Our results showed that tissue block culture method which is not easy to purify cells took longer time to get endometrial epithelium cells than the enzymatic digestion culture method.The enzymatic digestion culture method got high-viability and high-purity cells in 24 hours.In conclusion，enzymatic digestion culture method is appropriate for canine endometrial cell culture，which can be used for the further study.

Key words：canine；endometrial cells；tissue block culture method；enzymatic digestion culture method

Corresponding authors: XU Jian-qin；LIU Feng-hua

通訊作者：許劍琴，E-mail：jianqinxucau@126.com；劉鳳華，E-mail：liufenghua1209@126.com

作者簡介：宗振平（1988-），女，碩士，研究方向為小動物中獸醫，E-mail：lanberzong@163.com

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃重點項目：防制畜禽呼吸、消化系統常見病證中獸藥創制及應用示范（2011BAD34B-01）；北京市教委創新團隊的建設與教師職業發展的項目（PXM2-013_014207_000067）

收稿日期：2014-06-12

中圖分類號：S858.292

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0020- 04