雞堆型艾美耳球蟲Hsp90克隆表達及其核酸疫苗的免疫保護作用

馮　儷，聶思靜，黃藝華，黃小丹，蔡皓璠，馬德星，李廣興（.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱50030；.黑龍江職業學院，黑龍江哈爾濱50080）

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雞堆型艾美耳球蟲Hsp90克隆表達及其核酸疫苗的免疫保護作用

馮儷1，聶思靜1，黃藝華1，黃小丹1，蔡皓璠2，馬德星1，李廣興1
（1.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江職業學院，黑龍江哈爾濱150080）

摘要：利用RT-PCR方法從雞堆型艾美耳球蟲（E.acervulina）子孢子中成功克隆熱休克蛋白90（Hsp90）基因，并構建其原核和真核表達質粒pET30a-Hsp90和pVAX-Hsp90。重組表達的89 kD可溶蛋白免疫家兔制備多克隆抗體，間接ELISA和Western-Blot表明，其反應性和特異性良好。真核表達質粒pVAX-Hsp90體外瞬時轉染間接免疫熒光檢測可見成功表達。雛雞真核表達質粒免疫后進行攻蟲保護試驗，結果表明，pVAX-Hsp90組較空載體組及PBS組增重極明顯（P＜0.01），且腸道病變減輕，OPG減少，抗球蟲指數為166.17。綜上初步評價了Hsp90核酸疫苗的免疫保護作用，表明Hsp90是一種潛在的雞球蟲保護性抗原。

關鍵詞：堆型艾美耳球蟲；熱休克蛋白90；克隆表達；核酸疫苗；免疫保護

雞球蟲是由包括堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）在內的7種常見艾美耳球蟲引起的一種寄生蟲病。寄生蟲侵入雞腸道組織并分裂增殖使其發生損傷而導致腹瀉、血便和體重降低，對養禽業造成嚴重的經濟損失[1]。熱休克蛋白90 （heat shock protein 90，Hsp90）是熱休克蛋白家族中的重要成員，廣泛存在于從低等原核生物到高等哺乳動物中。Hsp90是一種進化保守的蛋白質，在分子伴侶功能、細胞循環調控、抗原傳遞方面發揮著重要作用[2]。已有研究表明Hsp90在弓形蟲的生長中發揮重要作用，用重組Hsp90蛋白免疫小鼠可產生保護效果且血清抗體IgG提高[3]，提示Hsp90對弓形蟲免疫來說是一種有效的保護性抗原。本研究采用原核表達系統克隆表達了E.acervulina Hsp90蛋白，利用重組蛋白免疫家兔制備多克隆抗體對其進行了生物學特性鑒定，并構建pVAX-Hsp90真核表達質粒免疫雛雞后進行攻蟲試驗來檢測Hsp90核酸疫苗抗球蟲感染的保護作用。

1　材料與方法

1.1寄生蟲、菌株、質粒和試驗動物E.acervulina由本實驗室保存。pMD18-T載體，購自寶生物工程（大連）有限公司。pET-30a（＋）、pVAX載體由本實驗室保存。E.coli JM109和Rosetta，購自北京全式金生物技術有限公司。雌性大白兔和一日齡雛雞，購自哈爾濱市某養殖場。

1.2主要試劑RT-PCR相關常規試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司。HRP和FITC標記的羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。TRIZol，購自Sigma公司。

1.3Hsp90基因克隆根據GenBank公布的E. acervulina Hsp90 cDNA序列（GenBank：AY459429.1）設計引物：F1：5′-AATCCCTAACCTCATCCACGTC-3′；R1：5′-GCACCGCCTTTGTCTGTACT-3′。按TRIZol Reagent說明書提取子孢子總RNA，按反轉錄試劑盒合成cDNA，按反應條件進行RT-PCR。并連接pMD18-T，進行測序。

1.4pET-30a-Hsp90和pVAX-Hsp90重組質粒的構建及鑒定根據測序結果分別設計一對原核引物與真核引物：P1: 5′-CGCGGATCCATGGAGAACAAGGAGACCTT-3′，P2：5′-ACGCGTCGACTTAGTCTACCTCCTCCATCT-3′；U1：5′-CGCGGATCCGC?CACCATGGAGAACAAGGAGACC-3′，U2：5′-AACTGCAGTTAGTCTACCTCCTCCATCT-3′，下劃線為插入的酶切位點，斜體為Kozak序列。回收純化DNA后分別連接pET-30a、pVAX表達載體，進行酶切鑒定。

1.5Hsp90的表達、純化及鑒定將pET-30a-Hsp90轉化大腸桿菌Rosetta感受態，經1 mmol/L IPTG誘導后收集菌體，超聲破碎，進行SDS-PAGE分析。以鼠抗His單抗為一抗，HRP標記羊抗鼠IgG為二抗對重組蛋白進行Western-Blot分析。表達蛋白通過鎳柱進行純化。

1.6多克隆抗體的制備及鑒定用純化的Hsp90蛋白免疫大白兔，參考[4]制備多克隆抗體，間接ELISA多析測定抗體效價。用孢子化卵囊蛋白的SDS-PAGE，以1∶1 000倍稀釋的多抗血清為首抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，通過Western-Blot檢測抗體特異性。

1.7Hsp90體外瞬時表達按Invitrogen Lipofectamine 2000說明書，將pVAX-Hsp90轉染Hela細胞，轉染24 h后，多聚甲醛固定，以1∶100稀釋多抗血清作為首抗，1∶200稀釋的FITC標記山羊抗兔IgG為二抗，熒光顯微鏡觀察Hsp90表達情況。1.8動物免疫保護試驗1日齡雛雞隨機分為4組，每組15只，即未免疫未攻蟲組（None）、PBS對照組（PBS）、pVAX免疫組（pVAX）、pVAX-Hsp90免疫組（pVAX-Hsp90）。14、21日齡每只雞胸部肌肉注射100 μg真核質粒或100 μL PBS，28日齡除None組外均口服接種1×105個孢子化卵囊進行攻蟲。14 d、28 d和35 d逐羽稱重，計算平均增重及相對增重率、攻蟲后第6天記錄十二指腸病變計分和每克糞便卵囊排出數（OPG）并計算抗球蟲指數（Anticoccidial index，ACI），用以評價免疫保護效果[5]。

1.9數據處理所有數據采用GraphPad Prism 5.0軟件進行分析，比較各組間的差異。

2　結果

2.1E.acervulina Hsp90克隆本試驗通過RT-PCR擴增得到2 433 bp大小的序列（圖1），通過基因測序后在NCBI上進行BLAST分析顯示，其與E.acervulina clone 62 Hsp90（GenBank：AY459429.1）同源性為99.7%，表明成功克隆得到E.acervulina Hsp90基因，并提交GenBank，登錄號為：KF053874.1。該序列包含一個2 139 bp ORF，編碼713 aa，蛋白大小為82.5 kD。

2.2pET-30a-Hsp90和pVAX-Hsp90的鑒定用BamHⅠ和SalⅠ對pET-30a-Hsp90或BamHⅠ和PstⅠ對pVAX- Hsp90進行酶切鑒定結果與預期相符（圖1）。

圖1　pET- 30a- Hsp90和pVAX- Hsp90的鑒定M：DL-10 000 DNA Marker；1：Hsp90 RT-PCR產物；2、3：pET30a-Hsp90單/雙酶切；4、5：pVAX-Hsp90單/雙酶切

2.3Hsp90原核表達及鑒定原核重組蛋白進行SDS-PAGE分析，pET-30a-Hsp90在89 kD處出現特異性條帶，并且以分泌形式表達，通過鎳柱對其進行純化后條帶單一（圖2）。pET-30a-Hsp90誘導表達蛋白與His單抗反應在89 kD處可見一特異性條帶（圖3）。

圖2　pET- 30a- Hsp90表達產物的SDS- PAGE分析M：蛋白Marker；1：pET30a-Hsp90誘導后；2：純化后Hsp90蛋白；3：pET-30a誘導后；4：pET30a-Hsp90上清；5：pET30a-Hsp90沉淀

圖3　His單抗檢測pET- 30a- Hsp90M：Pageruler Prestained Protein Ladder；1：pET30a-Hsp90重組蛋白；2：pET-30a IPTG誘導

2.4多克隆抗體生物學特性鑒定經間接ELISA法檢測得所制備的多抗效價為218；Western-Blot顯示多抗血清可與孢子化卵囊蛋白特異性結合（圖4），說明多抗血清反應性和特異性良好。

圖4　多克隆抗體的Western BlotM：Blue plusⅡProtein Marker；1：孢子化卵囊蛋白

2.5pVAX-Hsp90轉染Hela細胞IFA鑒定pVAX-Hsp90轉染Hela細胞進行IFA檢測可見到特異性綠色熒光信號，而轉染pVAX空載體的細胞及細胞對照孔未出現熒光信號（圖5），說明多抗血清可以與真核表達的Hsp90蛋白發生特異性結合，pVAX-Hsp90構建成功。

2.6免疫保護效果動物免疫試驗結果顯示，pVAX與pVAX-Hsp90免疫組增重均高于PBS對照組，且pVAX-Hsp90極顯著高于pVAX免疫組與PBS對照組（P＜0.01）（圖6）；pVAX-Hsp90免疫組卵囊排出量顯著低于pVAX免疫組與PBS對照組（P＜0.05）（圖7）；pVAX-Hsp90免疫組十二指腸病變計分極顯著低于對照組（P＜0.01）（圖8）；綜合評價pVAX-Hsp抗球蟲ACI為166.17（表1），提示Hsp90核酸疫苗對球蟲感染具有保護作用。

圖5　真核轉染間接免疫熒光　20×A：Hela細胞對照；B：pVAX空載體對照；C：pVAX-Hsp90轉染Hela細胞

3　討論

研究表明，在原蟲病中Hsp90對于維持細胞穩態、抵抗外源病原微生物入侵等方面有重要作用。弓形蟲Hsp90是由速殖子分泌，Echeverria等[6]利用格爾德霉素（GA）抑制弓形蟲Hsp90功能后，發現速殖子向緩殖子轉變受到阻礙，說明弓形蟲Hsp90對蟲體入侵宿主細胞及寄生蟲在宿主細胞內的生長發育起關鍵作用；抑制錐蟲Hsp90功能，可使上鞭毛體發育停滯在細胞周期的G1期，從而阻礙了錐蟲細胞的增殖[7]。Hsp90與球蟲的入侵和生長密切相關，在蟲體入侵感染過程中E. tenella Hsp90的表達量增加，且在蟲體的所有階段均有表達[8]。目前多項研究顯示，多種病原體Hsp90具有免疫原性，Raska等[9]在白色念珠菌感染小鼠試驗中檢測到Hsp90蛋白免疫可刺激產生高水平的血清抗體IgG，對小鼠產生一定保護作用；Abdian等[10]用碩大利什曼原蟲Hsp90制備的DNA疫苗免疫小鼠，檢測到脾細胞IFN-γ及IL-15表達量顯著增加，預示著機體產生Th1型細胞免疫應答，目前為止E.acervulina Hsp90抗原性研究尚未見相關報道。

圖6　攻蟲后增重情況　圖7攻蟲后第6天每克糞便的卵囊數　圖8攻蟲后第6天十二指腸病變計分*：兩組間差異顯著（P＜0.05）；**：兩組間差異極顯著（P＜0.01）

表1　免疫效果觀察

本試驗從堆型艾美耳球蟲子孢子中成功克隆得到Hsp90基因，用pVAX-Hsp90轉染Hela進行IFA檢測可見綠色熒光信號，說明Hsp90在體外成功表達，接著用pVAX-Hsp90真核質粒免疫雛雞并進行攻蟲試驗，與空載體免疫組和PBS對照組相比，雞增重極顯著增加，OPG和病變指數均顯著降低，ACI是目前為止評價保護效果的綜合指標，pVAX-Hsp90組免疫保護效果較好，ACI為166.17，大于160，且顯著高于pVAX組及PBS對照組，表明Hsp90是球蟲的一種保護性抗原，可用于雞球蟲病疫苗的研究。

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Cloning and expression of EimeriaacervulinaHsp90 gene and theimmuneprotection of its DNA vaccine

FENG Li1，NIE Si-jing1，HUANG Yi-hua1，HUANG Xiao-dan1，CAI Hao-fan2，MA De-xing1，LI Guang-xing1
（1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Heilongjiang Polytechnic，Harbin 150080，China）

Abstract：In this study，Eimeria acervulina Hsp90 gene was amplified by RT-PCR and cloned into the plasmid pET30a-Hsp90.The expressed pVAX-Hsp90 was expressed with a molecular weight of 89 kD.pVAX-Hsp90 was then purified and used to immunize the rabbit to generate its polyclonal antibody.Indirect ELISA and western-blot showed the antibody has highly reactivity and specificity . pVAX-Hsp90 was then used to immunize chickens to test its immunoprotection effect . The results showed that pVAX-Hsp90 group had significantly high body weight gains（P＜0.01）lower intestine lesion score and occyst shedding compared with control groups, and the ACI is 166.17.Our data suggest that Hsp90 has immunoprotective effect and could be used as a potential protective antigen for chicken coccidiosis.

Key words：E.acervulina；Hsp90；coccidiosis；DNA vaccine；immune protection

Corresponding author：LI Guang-xing

通訊作者：李廣興，E-mail：ligx@neau.edu.cn

作者簡介：馮儷（1989-），女，碩士，研究方向為基礎獸醫學，E-mail：fengli19896@sina.com

基金項目：國家自然科學基金項目（31172295；31272569）；2013年黑龍江省普通高等學校動物普通疾病防治重點實驗室開放課題

收稿日期：2014-10-10

中圖分類號：S852.72+3

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0010- 04