鼠疫菌素的克隆表達與活性分析

王　婷，劉文華，鄒　玲，張　燦，任慧英（青島農業大學動物科技學院，山東青島266109）

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鼠疫菌素的克隆表達與活性分析

王婷，劉文華，鄒玲，張燦，任慧英
（青島農業大學動物科技學院，山東青島266109）

摘要：為了研究鼠疫菌素的抑菌作用，PCR擴增并克隆鼠疫菌素（pst）基因，構建鼠疫菌素原核重組表達質粒pET28a-pst，在大腸桿菌BL21中表達。經His標簽蛋白純化柱純化獲得重組鼠疫菌素蛋白，并檢測表達蛋白的抑菌活性。結果表明，鼠疫菌素基因長1 074 bp，重組鼠疫菌素為44 kD，以包涵體形式表達。純化的鼠疫菌素對金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌O78具有一定的抑菌作用。研究結果將為進一步研究鼠疫菌素的應用奠定基礎。

關鍵詞：鼠疫菌素；克隆；原核表達；抑菌活性

Expression and Antibacterial Activity Analysis of Pesticin WANG Ting，LIU Wen-hua，ZOU Ling，ZHANG Can，REN Hui-ying

（College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）
Abstract：In order to investigate the antibacterial activity of pesticin（pst），pesticin gene was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression plasmid pET28a-pst and expressed in BL21.The recombinant pesticin was purified with His-Tagged Protein Purification Kit and the antibacterial activity was analyzed .Our results showed that the full length of pesticin gene was 1 074 bp，and the recombinant pesticin was 44 kD.The antibacterial test results showed that purified pesticin had antibacterial activities against Staphylococcus aureu25923 and Escherichia.coli O78.
Key words：pesticin；cloning；prokaryotic expression；antibacterial activity
Corresponding authors：REN Hui-ying；ZHANG Can

細菌耐藥性以及耐藥菌感染是人醫和獸醫臨床共同面臨的一大難題。以大腸桿菌為例，全球每年因產腸毒素大腸桿菌（ETEC）引起的感染超過6.5億例，并導致約80萬例病人死亡[1]。據王占華報道[2]，分離自醫院的854株大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率高達87%，對慶大霉素和美絡西林的耐藥率超過70%，對頭孢哌酮和頭孢噻吩的耐藥率均超過50%。大腸桿菌引起的初生仔豬腹瀉、雞大腸桿菌性敗血癥是動物養殖中的常見病，其發病率在細菌病中居首位。從華北地區分離的雞源大腸桿菌中84.76%對四環素耐藥，70.12%對多西環素耐藥[3]；豬肉中大腸桿菌可耐受的藥物種類達8～11種，雞肉中大腸桿菌對7～8種藥物耐藥[4]。盡管阿米卡星未被批準為獸藥，但雞肉源大腸桿菌對阿米卡星的耐藥率達16.5%。細菌的廣泛耐藥性使抗生素治療越來越困難，因此開發能有效規避細菌耐藥性的抗生素替代品乃當務之急。

鼠疫菌素由鼠疫耶爾森菌產生，是具有溶菌酶活性的細菌素，可裂解細菌細胞壁中的肽聚糖，從而發揮殺菌作用。除可直接作用于革蘭陽性菌外，鼠疫菌素還可以殺死親緣關系較近的革蘭陰性菌。研究發現[5]，鼠疫菌素能特異靶向致病性大腸桿菌表面的FyuA蛋白，從而對大腸桿菌產生殺傷作用。FyuA是耶爾森菌強毒力島中fyuA基因編碼產物，大部分致病性大腸桿菌攜帶fyuA基因[6]，從而成為鼠疫菌素的靶細胞。國內外對鼠疫菌素的殺菌作用鮮有報道，為了進一步研究鼠疫菌素的殺菌效果，本研究對鼠疫菌素基因進行克隆表達，并對其進行活性分析，以期為人和動物細菌病的控制提供新型的抗生素替代品。

1　材料與方法

1.1質粒與菌株克隆載體pMD19-T，購自TaKaRa公司；表達載體pET28a、大腸桿菌DH5α和BL21均為本實驗室保存，鼠疫菌素DNA模板由云南省地方病防治所提供，金黃色葡萄球菌ATCC- 25923及O78型大腸桿菌分離株均為本實驗室保存。

1.2引物與主要試劑限制性內切酶、PCR產物回收試劑盒和T4 DNA連接酶，均購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒，均購自北京康為世紀生物科技有限公司。上游引物pstF：5′-CCGGAATTCATGTCAGATACAA TG-3′，下游引物pstR：5′-CGCGTCGACTTATTTTAACAATC-3′，酶切位點用下劃線表示，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。慶大霉素及林可霉素藥敏紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產品。

1.3鼠疫菌素基因的克隆及重組表達載體的構建以鼠疫菌素DNA為模板，PCR擴增鼠疫菌素基因。將目的基因連接到pMD19-T載體上，獲得質粒pst/T，測序并進行序列分析。將鼠疫菌素基因進一步克隆到pET28a表達質粒，對重組質粒進行PCR及雙酶切鑒定、測序。將測序正確的表達質粒轉化BL21感受態細胞，獲得表達鼠疫菌素pst的重組菌pET28a-pst/ BL21。

1.4重組蛋白pst的表達及條件優化將重組表達菌接入含有100 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃培養至菌液OD值為0.6，加入不同濃度的IPTG進行誘導，在不同時間分別取樣，SDSPAGE檢測重組蛋白的表達情況，分析不同誘導劑濃度和誘導時間對重組蛋白表達量的影響，確定最佳誘導表達條件。

1.5重組蛋白pst的可溶性檢測及Western-Blot鑒定離心收集經IPTG在最佳條件下誘導表達后的菌體，PBS重懸后在冰浴條件下進行超聲波裂解，裂解條件為：冰浴間歇超聲，超聲3 s，間歇1 s，待菌液較清亮時，約30 min停止超聲，12 000 r/min （4℃）離心5 min，將上清和沉淀（PBS重懸）分別加入1×SDS上樣緩沖液，煮沸后進行SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的表達形式。參照文獻[7]進行Western-Blot分析。鼠抗His標簽為首抗（1∶1 500），HRP標記羊抗鼠IgG為二抗（1∶3 000），DAB顯色。1.6重組蛋白pst的純化將重組表達菌進行超聲破碎，離心收集沉淀。將包涵體蛋白經洗滌后變性溶解，對包涵體粗提取物進行透析與復性，4℃條件下進行尿素梯度透析復性（6、4、2、1、0 mol/L各12 h）。將復性的pst蛋白溶液用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化，收集目的蛋白峰后進行SDS-PAGE分析蛋白純度。以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.7重組蛋白pst的抑菌試驗將金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌O78菌株分別經液體培養至對數期（菌液濃度達108CFU/mL），取200 μL菌液在普通瓊脂平板表面均勻涂布，將滅菌牛津杯（直徑8 mm）放置于培養基的表面，在其中加入200 μL濃度為1 mg/mL的純化蛋白，慶大霉素和林可霉素為抗生素對照，37℃溫箱中培養18 h左右，測量抑菌圈大小。

1.8重組蛋白pst的溶菌活性復蘇金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌O78首株，分別進行液體培養，37℃培養8 h，用LB肉湯依次倍比稀釋到10-5，將蛋白與菌液相互作用，同時設PBS對照，作用2 h后，取出100 μL，用LB肉湯依次倍比稀釋到10-3和10-2，取400 μL加至無菌平皿中，倒入約50℃的培養基，充分搖勻，每個稀釋度重復2次，凝固后倒置培養24 h，進行計數。

2　結果與分析

2.1鼠疫菌素基因的克隆及測序用pst引物對擴增鼠疫菌素基因，并克隆入pMD19-T載體。將重組質粒進行PCR擴增，得到與預期1 074 bp大小一致的條帶（圖1）。經測序比對分析，克隆基因與鼠疫菌素pst基因（GenBank號為NC-017159.1）的同源性為100%。

2.2pst重組表達載體pET28a-pst的構建將質粒pst/T經雙酶切后回收目的條帶，插入pET28a，構建pET28a-pst重組表達質粒。PCR及酶切分析均得到與預期大小相當的條帶，重組質粒的測序分析表明插入的片段正確（圖2）。

2.3pst表達條件的優化將重組質粒轉化至BL21，IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE分析。與空質粒相比，出現與預期44 kD一致的蛋白條帶。蛋白誘導優化分析結果顯示0.8 mmol/LIPTG，誘導6 h效果最佳（圖3、4）。

圖1　pst基因的PCR擴增M：DNA標準分子質量；1：pst基因的PCR產物

圖2　pET28a- pst的雙酶切結果M：DNA標準分子質量；1：pET28a-pst的雙酶切；2：pET28a-pst

圖3　IPTG濃度對pst表達的影響M：標準蛋白分子質量；1～8：重組菌分別用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L的IPTG進行誘導；9：空質粒表達菌

圖4　誘導時間對pst表達的影響M：標準蛋白分子質量；1：空質粒表達菌；2～9：重組菌分別誘導1、2、3、4、5、6、7、8 h

2.4重組蛋白pst的可溶性檢測及Western-Blot鑒定將誘導表達的菌體經超聲裂解，分別取上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳。結果表明，沉淀中有大量的目的蛋白條帶，而上清中僅有少量的蛋白條帶，因此pst重組蛋白主要以包涵體的形式存在（圖5）。將經IPTG誘導的重組菌pET28apst/BL21經SDS-PAGE電泳后進行Western-Blot鑒定。結果表明，重組蛋白能與抗His的單克隆抗體結合，且符合44 kD的預期大小。

2.5重組蛋白pst的純化與鑒定將重組表達菌的包涵體蛋白經變性與透析復性后進行蛋白純化。純化蛋白經SDS-PAGE分析，證明與預期的44 kD大小相符。

2.6重組蛋白pst的抑菌試驗平板抑菌試驗結果表明，重組蛋白pst能夠對金黃色葡萄球菌ATCC 25923和O78型大腸桿菌產生抑菌效果，抑菌圈大小分別為16 mm和12 mm。

2.7重組蛋白pst的溶菌活性通過蛋白與菌液相互作用后，與PBS對照組相比，金黃色葡萄球菌細菌數下降22%，大腸桿菌O78細菌數下降14%。

圖5　目的蛋白pst的可溶性鑒定M：標準蛋白分子質量；1：菌體裂解上清；2：菌體裂解沉淀

3　討論

細菌素是細菌產生的一種具有殺菌作用的蛋白質，通常認為，細菌素只能作用于與它同種不同菌株的細菌以及與它親緣關系相近的細菌[8]。細菌素可抑制多種病原菌，但抑菌譜的寬窄差異較大。如乳球菌素僅能抑制其他乳球菌，而戊糖片球菌產生的細菌素對綠膿桿菌、克雷伯菌及李斯特菌具有抑制作用[9]。細菌素的作用機制多種多樣，主要分能量依賴性和非能量依賴性兩種。鼠疫菌素是比較獨特的細菌素，具有溶菌酶活性，能水解肽聚糖成分。肽聚糖是細菌細胞壁特有的成分，細菌細胞壁的結構存在差異，革蘭陰性菌的肽聚糖層有外膜包裹，而革蘭陽性菌肽聚糖層暴露在表面，因此理論上鼠疫菌素可對革蘭陽性菌產生直接殺傷作用。文獻報道，鼠疫菌素對革蘭陰性的殺傷作用需要依賴于目標細菌表面特定的外膜蛋白FyuA，FyuA是耶爾森菌強毒力島中fyuA基因的編碼產物，大部分致病性大腸桿菌攜帶fyuA基因[3，10]，從而成為鼠疫菌素的靶細胞。理論上鼠疫菌素對革蘭陽性菌，如金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌及大部分致病性大腸桿菌具有裂解作用。

本研究發現，人工表達的鼠疫菌素對金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌O78具有抑菌作用，對鼠疫菌素作用機理的深入研究將為開發治療細菌病的抗生素替代品奠定基礎。

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通訊作者：任慧英，E-mail：renren0228@sina.com；張燦，E-mail：cleverflame@163.com

作者簡介：王婷（1990-），女，碩士生，主要從事獸醫微生物與免疫學方向的研究，E-mail：wangting900603@163.com

基金項目：山東省自然科學基金（ZR2009DM009）；山東省自然科學基金（ZR2013CQ024）

收稿日期：2014-10-27

中圖分類號：R 516.8

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0006- 03