新孢子蟲對小鼠致病力及在小鼠體內動態分布的研究

龍煙朦，高鴻博，馬　磊，2，李木子，2，劉　群，2，劉　晶，2（.中國農業大學動物醫學院，北京海淀0093；2.農業部動物流行病學與人畜共患病重點實驗室農業部國家動物寄生原蟲實驗室，北京海淀0093）

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新孢子蟲對小鼠致病力及在小鼠體內動態分布的研究

龍煙朦1，高鴻博1，馬磊1，2，李木子1，2，劉群1，2，劉晶1，2
（1.中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193；2.農業部動物流行病學與人畜共患病重點實驗室農業部國家動物寄生原蟲實驗室，北京海淀100193）

摘要：小鼠是研究新孢子蟲的動物模型。通過小鼠毒力試驗，檢測3株新孢子蟲（Nc-1，Nc-LIV和Nc-BJ）對BALB/ c小鼠的致病力差異；同時研究了低劑量Nc-LIV株（1×106）感染后，新孢子蟲在小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦和后肢肌肉中的分布情況及其在血清中抗體的動態變化規律。結果顯示，Nc-LIV對BALB/c小鼠的毒力最強，Nc-BJ其次，Nc-1最弱。小鼠血清中新孢子蟲抗體在感染后4 d出現至第32天達到峰值。感染后第8天在腦組織中可檢測到新孢子蟲特異性基因Nc-5，在第32天達到峰值后下降；其他組織中則分布很少。通過觀察新孢子蟲Nc-LIV在小鼠體內各器官組織動態分布的規律，為進一步建立小鼠感染新孢子蟲的動物模型，研究新孢子蟲病奠定了基礎。

關鍵詞：新孢子蟲；毒力試驗；組織分布；腦荷蟲量

高鴻博（1994-），女，本科生，從事動物醫學專業學習，E-mail：gaohongbo1994@163.com

注：高鴻博與龍煙朦對本文具有同等貢獻

新孢子蟲（Neospora caninum）隸屬于原生動物門（Protozoa），頂復亞門（Apicomplexa），孢子蟲綱（Sporozoea），真球蟲目（Eumeriina），肉孢子蟲科（Sarcocystidae），新孢子蟲屬（Neospora）。新孢子蟲主要寄生在中樞神經系統、肌肉細胞、肝、腦及多種有核細胞內，引起孕畜的流產和死胎，以及新生兒的運動神經系統障礙[1]。盡管新孢子蟲分布廣泛、中間宿主眾多，但在全世界范圍分離到的蟲株非常有限。自1988年Dubey等從先天性腦脊髓炎的犬腦組織中分離第一株新孢子蟲并命名為Nc-1株后[2]，研究人員先后從不同的宿主體內分離到新孢子蟲蟲株約80株[3]。其中Nc-LIV分離自英國先天感染的幼犬神經組織[4]。Nc-BJ株則于2011年分離自北京地區新孢子蟲抗體陽性牛血液淋巴細胞[5]。我國奶牛新孢子蟲感染情況普遍，有流產史的母牛與新孢子蟲血清抗體陽性密切相關，說明新孢子蟲感染是奶牛流產的重要原因[6-7]。2007年對流產奶牛進行診斷時發現流產胎牛的腦組織中存在新孢子蟲，從病原學角度證實了新孢子蟲是引起奶牛流產的原因[8]。

牛是新孢子蟲的重要中間宿主，但對牛進行新孢子蟲人工感染比較困難且代價昂貴。小鼠是研究新孢子蟲的常見實驗模型，其中某些近交系小鼠，如BALB/c小鼠對新孢子蟲易感性很強[9]。鄧沖等人成功建立了新孢子蟲病BALB/c小鼠的感染模型，報道了新孢子蟲Nc-1蟲株的生物學特性、致病情況，并對其在小鼠各組織器官的分布情況進行了常規PCR檢測[10]。本研究以BALB/c小鼠為實驗動物，通過人工感染新孢子蟲標準株Nc-1、Nc-LIV、北京分離株Nc-BJ研究不同來源的新孢子蟲分離株對小鼠的致病性差異；檢測Nc-LIV株在小鼠體內動態分布情況，為進一步研究大型動物的新孢子蟲病提供參考資料。

1　材料與方法

1.1試驗材料新孢子蟲標準株Nc-1，Nc-LIV和北京株Nc-BJ，由中國農業大學動物醫學院，農業部國家動物寄生原蟲實驗室傳代并保存；6周齡近交系BALB/c雌性小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司；羊抗鼠IgG-HRP抗體，購自北京欣經科生物技術有限公司；全血組織細胞基因組DNA快速提取試劑盒，購自北京艾德萊生物技術公司；PCR相關試劑，購自北京全式金生物技術有限公司；實時熒光定量PCR檢測試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1毒力試驗30只BALB/c小鼠隨機等分成3組。每組分別腹腔接種Nc-1，Nc-LIV或Nc-BJ株5×106個速殖子/只，連續觀察90天并記錄小鼠的臨床癥狀、體重變化和死亡時間。毒力試驗重復一次，綜合兩次試驗的結果繪制存活曲線。

1.2.2Nc-LIV在小鼠體內動態分布

1.2.2.1試驗設計將35只BALB/c小鼠分成兩組，試驗組28只，對照組7只。試驗組腹腔接種Nc-LIV株1×106個速殖子/只，對照組腹腔注射300 μL PBS/只。接種后每天觀察并記錄小鼠的臨床癥狀、體重變化和死亡時間。分別于接種后第1、2、4、8、16、32天和第64天，試驗組隨機選取3只小鼠，對照組選取1只小鼠，分離血清，斷頸處死。無菌條件下剖檢，采集心、肝、脾、肺、腎、腦和后肢肌肉組織。樣本保存于-80℃待檢。提取腦組織DNA，進行實時熒光定量PCR檢測，計算小鼠感染新孢子蟲的腦荷蟲量和動態變化。

1.2.2.2血清新孢子蟲抗體檢測應用間接ELISA方法檢測小鼠血清中抗體水平。收集新鮮釋放的Nc-1速殖子，超聲裂解制備新孢子蟲全蟲抗原。以全蟲抗原100 ng/孔包被，待檢小鼠血清1∶100稀釋，二抗羊抗鼠IgG-HRP 1∶5 000稀釋，測定OD450nm/630 nm值。

1.2.2.3組織新孢子蟲檢測應用全血組織細胞基因組DNA快速提取試劑盒提取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦和后肢肌肉組織DNA。以小鼠各組織DNA為模板，Np6（5′-CAGTCAACCTACGTCTTCT-3′）和Np21（5′-GTGCGTCCAATCCTGTAAC-3′）為特異性引物，擴增新孢子蟲特異性基因Nc-5基因。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增結果。

1.2.2.4腦組織荷蟲量檢測應用實時熒光定量PCR方法擴增腦組織中新孢子蟲的Nc-5基因和小鼠的18S基因，經計算確定小鼠腦組織荷蟲量。Nc-5特異性引物為Np6/Np21；小鼠18S特異性引物上游F：5′-ATTAGATACAGAACCAACCCAC-3′，下游R：5′-TGAATGATCCGTCGCAGAC-3′。根據Nc-5標準品和腦組織18S DNA標準品繪制標準曲線。每20 μL反應體系中包括：2 μL DNA模板，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），SYBR premix Ex TaqⅡ染料10 μL和ddH2O 6.4 μL。反應結束后分別根據各濃度目的基因和內參基因的Ct值，運用7500 software分析擴增曲線和標準曲線。

1.3數據處理與分析試驗數據采用SPSS 13.0軟件和GraphPad Prism 5.0處理分析。

2　結果與分析

2.1毒力試驗

2.1.1臨床癥狀及體重變化3個感染組小鼠臨床癥狀類似。感染前期主要表現為活動性下降，被毛蓬亂、拱背蜷縮、全身震顫等。60 d后大部分小鼠神經癥狀加重，出現活動障礙、后肢僵直、身體重心偏移和原地轉圈等癥狀。感染前期各組體重變化無明顯差異，后期對照組體重平穩上升，試驗組體重波動大，且個體差異增大。接種后15 d試驗組小鼠體重開始下降，第30天后實驗組與對照組差異明顯，至第71天Nc-LIV組小鼠全部死亡且體重下降最明顯，Nc-BJ組次之，Nc-1組小鼠體重變化幅度最小（圖1）。

2.1.2存活率接種后第4天Nc-LIV組小鼠開始死亡，在接種后71 d全部死亡；Nc-BJ組小鼠于第6天開始死亡；Nc-1組小鼠于第8天開始死亡。至接種后88 d，Nc-BJ組存活1只，Nc-1組存活6只（圖2）。

2.2Nc-LIV在小鼠體內動態分布

圖1　小鼠感染新孢子蟲后體重變化

圖2　小鼠存活曲線

2.2.1臨床癥狀和病理變化小鼠接種Nc-LIV速殖子（1×106個）后第16天出現被毛凌亂，但精神狀態良好。第26天至第53天表現精神萎靡、消瘦，出現拱背顫抖、后肢僵直等神經癥狀。接種后第8天有肺臟出血和肝臟腫大充血等病理變化；腎臟和心臟也出現充血現象。各采樣點剖檢均未發現有腹水，后肢肌肉組織表觀正常，未見出血情況。

2.2.2血清抗體水平變化接種后第3天可檢測到新孢子蟲特異性抗體，隨后抗體水平緩慢增加，第8-16天快速增加，于第32天達到峰值后緩慢下降（圖3）。

圖3　小鼠血清新孢子蟲抗體

2.2.3新孢子蟲在小鼠組織中分布情況以各取樣點的組織DNA為模板，PCR擴增新孢子蟲Nc-5特異性基因。在接種后第2、4天的部分組織中檢測到Nc-5基因。第8天肺臟中檢測到Nc-5。第32天腦組織中檢測到Nc-5基因片段，大小為328 bp。其他組織器官中均未檢測到（圖4）。

圖4　小鼠腦組織Nc- 5擴增結果1～7：Nc-LIV組接種后第1、2、4、8、16、32、64天；8：PBS組接種后第32天；9：陰性對照；10：陽性對照；M：DNA Marker

2.2.4腦荷蟲量檢測使用絕對熒光定量PCR檢測各采樣點腦組織DNA中新孢子蟲含量。接種后第4天起腦荷蟲量逐步增加；第32天達峰值，每微克組織中可檢測到約1 286個蟲體；第32天至第64天，腦荷蟲量下降。

圖5　熒光定量PCR檢測腦組織DNA中荷蟲量

3　討論

通常根據新孢子蟲對小鼠致病力來判定其毒力強弱。本試驗中小鼠腹腔接種3種新孢子蟲蟲株，連續觀察90 d，其中Nc-LIV組小鼠最早出現臨床癥狀和發生死亡，在接種后第71天死亡率100%；Nc-BJ組小鼠死亡率90%；Nc-1組小鼠死亡率僅40%。表明Nc-LIV對BALB/c小鼠的毒力最強，Nc-BJ次之，Nc-1最弱。本課題組在前期分離Nc-BJ株時曾對其毒力

進行過初步研究，發現小鼠感染Nc-BJ后第6天出現死亡，觀察僅持續到感染后第32天，死亡率為43%[8]。本研究發現，小鼠感染Nc-BJ株后死亡趨勢與之前的研究結果相似，并通過延長觀察時間及與Nc-1和Nc-LIV株的對比試驗進一步完善了新孢子蟲對小鼠的致病性研究。在三株新孢子蟲中Nc-LIV的致病性最強，Nc-BJ致病性居中，Nc-1的毒力最弱，可能與Nc-1在細胞上多次傳代，導致毒力減弱有關[11]。

新孢子蟲Nc-5基因是其特異性基因，被廣泛應用于新孢子蟲感染的檢測[12-13]。在Nc-LIV株在小鼠體內的動態分布研究中，實時熒光定量PCR結果顯示，接種后第8天，小鼠腦組織DNA中檢測到新孢子蟲Nc-5基因，說明此時Nc-LIV已突破血腦屏障而侵入腦內。腦組織中蟲體含量32 d達到峰值，這與小鼠在接種后第26-53天期間表現出明顯的神經癥狀相符，隨后腦荷蟲量下降。結果與同等劑量Nc-BJ株在小鼠腦組織中荷蟲量變化趨勢類似[8]。而常規PCR只在感染后第32天，檢測出腦組織的Nc-5基因，其原因可能是由于新孢子蟲分布在小鼠組織中的數量少，常規PCR法敏感性低所致。其他組織器官中，僅在第8天的肺組織DNA中檢測到Nc-5基因，這與新孢子蟲的嗜組織性[14]，即對血管豐富的肺臟偏愛有關。

4　結論

通過對不同地區不同來源的3株新孢子蟲分離株對小鼠的致病力研究發現，Nc-LIV株對BALB/c小鼠的毒力最強，Nc-BJ株次之，Nc-1株最弱。初步了解了Nc-LIV在小鼠體內組織器官中的動態分布規律，為新孢子蟲病病原的進一步研究奠定了基礎。

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Virulenceand Dynamic Distribution of Neospora caninum in Mice

LONG Yan-meng1，GAO Hong-bo1，MA Lei1，2，LI Mu-zi1，2，LIU Qun1，2，LIU Jing1，2
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.China Key Laboratory of Animal
Epidemiology and Zoonosis，Ministry of Agriculture，and National Animal Protozoa Laboratory，Beijing 100193，China）

Abstract：Mice are animal models in Neospora caninum research.Virulence of three strains of N.caninum（Nc-1，Nc-LIV and Nc-BJ）was detected by virulence assay.Parasites distribution in tissues and dynamic variation of antibody were investigated when mice were infected with low doses of Nc-LIV（1×106）.Nc-LIV was the strongest virulence strain for BALB/c mice，Nc-BJ was the moderate virulence strain and Nc-1 was the weakest one.Serum antibodies to Neospora appeared in 4 days after infection and reached the peak in 32 days.N.caninum specific genes Nc-5 could be detected in the brains after 8 days and at the peak in 32 days after infection.Spread of tachyzoites of Nc-LIV among the tissues were traced in BALB/c mice for further establishment of an animal model and laid the foundation of the N.caninum research.

Key words：Neospora caninum；virulence assay；tissues distribution；parasitic burden in the brain

Corresponding author：LIU Jing

通訊作者：劉晶，E-mail：liujingvet@cau.edu.cn

作者簡介：龍煙朦（1993-），女，本科生，從事動物醫學專業學習，E-mail：long_yanmeng@126.com

基金項目：國家自然科學基金（31302075）；國家教育部博士點基金（20130008120010）

收稿日期：2015-08-26

中圖分類號：S852.72+3

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0003- 03