黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV及葫蘆科作物抗性遺傳改良研究進(jìn)展

孫玉燕，牛曉偉，范 敏(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,浙江杭州 310021)

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黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV及葫蘆科作物抗性遺傳改良研究進(jìn)展

孫玉燕，牛曉偉，范 敏*
(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,浙江杭州 310021)

摘 要：黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)是侵染葫蘆科作物的重要病毒之一,對(duì)葫蘆科作物的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。本文對(duì)CGMMV的分布和分類(lèi),全基因組序列、進(jìn)化關(guān)系及結(jié)構(gòu),CGMMV的檢測(cè)方法,以及葫蘆科CGMMV抗性的遺傳分析及遺傳改良包括抗性材料的篩選及種間雜交、基于基因工程的遺傳改良、miRNAs測(cè)序及人工miRNAs等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。另外,對(duì)葫蘆科作物CGMMV抗性遺傳改良中存在的問(wèn)題及應(yīng)對(duì)策略進(jìn)行了探討和展望。

關(guān)鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒;基因組;遺傳分析;遺傳改良

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20160232

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)隸屬于蕪菁花葉病毒科煙草花葉病毒屬［1］,具有較廣泛的寄主范圍,主要侵染黃瓜、西葫蘆、葫蘆、西瓜、甜瓜、南瓜、絲瓜、苦瓜和蛇瓜等葫蘆科作物［2］,也可侵染莧色藜、曼陀羅、馬齒莧、本氏煙和矮牽牛等作物［3］。CGMMV可引起葉片斑駁、系統(tǒng)花葉、褪綠、萎黃、褶皺,以及植株矮化、生長(zhǎng)緩慢、結(jié)果延遲等癥狀,在成熟期可導(dǎo)致果實(shí)腐爛和纖維化,失去食用和商業(yè)價(jià)值［4-6］,給葫蘆科作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。

1　CGMMV的分布和分類(lèi)

1.1分布范圍

目前,CGMMV在全世界30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有分布。最早于1935年由英國(guó)的Ainsworth報(bào)道在黃瓜上發(fā)生［7］,隨后傳入西班牙、德國(guó)、羅馬尼亞、希臘和波蘭等歐洲國(guó)家［8-12］; 20世紀(jì)60—70年代,因黃瓜、西瓜和瓠瓜引種而傳入亞洲的日本、印度和伊朗［13-15］; 20世紀(jì)80—90年代傳入韓國(guó)、我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)、前蘇聯(lián)、以色列和沙特阿拉伯［5,16-19］; 21世紀(jì)初,幾乎所有的歐洲國(guó)家,以及中亞、東亞和南亞一些國(guó)家均有發(fā)生［11-12］。近年開(kāi)始傳入北美洲的加拿大和美國(guó)［20-22］。2002年,中國(guó)口岸檢疫部門(mén)首次從日本引進(jìn)的種苗中發(fā)現(xiàn)CGMMV。2004年,廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局再次從日本進(jìn)口的南瓜種子上檢測(cè)到CGMMV［23］。隨后在遼寧、北京、浙江、河北、甘肅、海南等地發(fā)生多起進(jìn)口源性CGMMV,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。為此,2006年12月21日,農(nóng)業(yè)部發(fā)布了第788號(hào)公告,將CGMMV確定為全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物之一。

1.2分類(lèi)

根據(jù)報(bào)道地域和鑒別寄主莧色藜、曼陀羅等植物上的侵染癥狀,可將CGMMV分為6個(gè)株系［24］。

典型株系。即黃瓜綠斑駁花葉病毒。在英國(guó)和歐洲有報(bào)道［7］。果實(shí)上通常不引起癥狀,特定條件下在莧色藜上引起少量局部枯斑,不侵染曼陀羅和矮牽牛。

黃瓜桃葉珊瑚花葉株系。英國(guó)和歐洲有報(bào)道,印度也有類(lèi)似株系的報(bào)道。在果實(shí)上可以引起顯著的果實(shí)癥狀,在莧色藜上引起局部枯斑,而在曼陀羅上無(wú)癥狀。

西瓜株系。日本有報(bào)道［4］,在莧色藜上引起局部枯斑,而在曼陀羅上無(wú)該癥狀。

日本黃瓜株系。日本有報(bào)道［4］,在黃瓜上引起嚴(yán)重的果實(shí)畸形,在曼陀羅上引起局部枯斑,但莧色藜上無(wú)癥狀。

洋東株系。在洋東河日本的黃瓜上有記載,引起黃瓜果實(shí)畸形,在莧色藜、曼陀羅和矮牽牛上引起局部枯斑。

印度株系。在印度的葫蘆科植物上有記載,引起泡斑、矮化和產(chǎn)量降低;在莧色藜上引起局部枯斑,在接種曼陀羅的葉片上不表現(xiàn)癥狀,不侵染煙草和矮牽牛。

2　CGMMV全基因組序列及結(jié)構(gòu)

CGMMV為正單鏈線狀RNA病毒,病毒粒體為桿狀,大小為300×18 nm［25］。截止到2015年9 月17日,共有42個(gè)CGMMV分離物的全基因組序列提交到NCBI GenBank中,基因組大小約6.4 kb (6 325～6 425 bp) (表1),寄主包括西瓜、黃瓜、瓠瓜、南瓜、甜瓜、絲瓜和本氏煙草,分離物來(lái)源于日本、韓國(guó)、西班牙、俄羅斯、印度、以色列,以及中國(guó)臺(tái)灣、海南、遼寧、山東、河南、浙江等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。利用MEGA 5.10軟件對(duì)42個(gè)CGMMV的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),這42個(gè)分離物按照親緣關(guān)系遠(yuǎn)近聚為2個(gè)基因型:亞洲類(lèi)型和歐洲類(lèi)型(圖1)。其中來(lái)源于中國(guó)、韓國(guó)、日本、以色列、印度和加拿大的38個(gè)CGMMV分離物歸到亞洲類(lèi)型; SP,MC-1,MC-2 和VIROG-43M來(lái)源于西班牙和俄羅斯,屬于歐洲類(lèi)型。

CGMMV病毒含有5′端和3′端2個(gè)非編碼區(qū),5′端含有帽子結(jié)構(gòu),3′端有1個(gè)可接受組氨酸相似于tRNA狀的結(jié)構(gòu)［1］。帽子結(jié)構(gòu)具有加強(qiáng)外殼蛋白翻譯的穩(wěn)定性,使其不易被降解［26］。CGMMV編碼區(qū)包含4個(gè)開(kāi)放閱讀框,分別編碼129 /186 ku,29 ku和17.3 ku蛋白［27］。其中,186 ku蛋白是由129 ku蛋白的開(kāi)放讀碼框終止子通讀產(chǎn)生的,186 ku和129 ku蛋白均與病毒復(fù)制有關(guān),被稱為RNA依賴性聚合酶蛋白［27］。29 ku蛋白為運(yùn)動(dòng)蛋白,協(xié)助病毒在細(xì)胞間移動(dòng)［28］。17.3 ku蛋白為外殼蛋白,作為病毒粒子的重要的結(jié)構(gòu)亞基,保護(hù)核酸并協(xié)同介導(dǎo)病毒的長(zhǎng)距離運(yùn)輸［29］。

表1　GenBank中CGMMV全基因組序列信息

3　CGMMV的檢測(cè)方法

CGMMV的檢測(cè)技術(shù)有很多,包括生物學(xué)檢測(cè)、電子顯微鏡技術(shù)、血清學(xué)檢測(cè)、PCR檢測(cè)和熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization,FISH)檢測(cè)等。

圖1　CGMMV核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

3.1生物學(xué)檢測(cè)

生物學(xué)檢測(cè)鑒定是植物病毒檢測(cè)的傳統(tǒng)技術(shù),是其他檢測(cè)方法的重要基礎(chǔ),為植物病毒病原診斷提供了一定的幫助。秦碧霞等［30］在同一溫室中分離的病毒分離物不侵染莧色藜,但可在曼陀羅上產(chǎn)生局部褪綠斑,由此認(rèn)為分離到CGMMV的另一個(gè)株系。黃靜［31］取黃瓜病葉進(jìn)行摩擦接種,其中黃瓜、南瓜、葫蘆和西瓜癥狀表現(xiàn)為系統(tǒng)侵染,而莧色藜發(fā)病遲緩,出現(xiàn)紅色斑點(diǎn),曼陀羅上無(wú)癥狀,由此認(rèn)為該病毒分離物可能屬于日本西瓜株系。李海明等［32］將CGMMV分離物進(jìn)行生物學(xué)鑒定,在葫蘆科植物和莧色藜上均表現(xiàn)出發(fā)病癥狀,在黃瓜、南瓜、芋瓠、甜瓜上主要表現(xiàn)為系統(tǒng)花葉和有褪綠斑;而在莧色藜上表現(xiàn)為局部白色枯斑。接種結(jié)果初步表明,CGMMV-GX屬于西瓜株系。雖然鑒別寄主或指示植物在植物病毒的生物學(xué)檢測(cè)鑒定方面應(yīng)用廣泛,但存在時(shí)間長(zhǎng)、易受環(huán)境和季節(jié)影響等限制,需要與其他檢測(cè)方法結(jié)合才能得到較可靠的結(jié)果。

3.2電鏡檢測(cè)

電鏡檢測(cè)方法可直觀顯示病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)、病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)、寄主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化等［33］。對(duì)沙特阿拉伯CGMMV的1個(gè)株系應(yīng)用負(fù)染色方法進(jìn)行鑒定,觀察到侵染葫蘆的CGMMV粒體形狀為直桿狀,大小為300～325 nm［19］。黃靜［31］對(duì)接種CGMMV后的黃瓜病葉浸漬液經(jīng)2%的磷鎢酸負(fù)染后用透射電鏡觀察,觀察到直桿狀的病毒粒子,長(zhǎng)度大約為300 nm,寬度大約為18 nm,與CGMMV病毒的典型粒子具有相同的形態(tài)。Shang等［34］對(duì)純化后的CGMMV病毒顆粒進(jìn)行電鏡觀測(cè),發(fā)現(xiàn)典型的桿狀病毒顆粒。Liu等［35］對(duì)接種CGMMV后的黃瓜葉片進(jìn)行電鏡檢測(cè),發(fā)現(xiàn)典型的大小為300×18 nm的桿狀CGMMV病毒顆粒。利用光學(xué)相干斷層成像術(shù)(optical coherence tomography,OCT),將感染CGMMV的黃瓜種子與健康種子進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)感病的種子種皮與胚乳之間存在窄間隙,而健康的種子中則不存在該間隙,進(jìn)而將感病種子與健康種子區(qū)分［36］。由于電鏡檢測(cè)具有形態(tài)觀察的直觀性,對(duì)植物病毒的檢測(cè)鑒定起到了較好的輔助鑒定作用。

3.3血清學(xué)檢測(cè)

檢測(cè)植物病毒的血清學(xué)方法較多,依據(jù)的原理都是基于構(gòu)成不同病毒蛋白抗原決定簇的差異與相應(yīng)抗體的特異性結(jié)合。目前,在CGMMV的檢測(cè)上應(yīng)用最多的是酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定(ELISA)。使用改良的ELISA (M-ELISA)技術(shù)檢測(cè)黃瓜種子是否帶有CGMMV病毒,結(jié)果從800粒黃瓜種子中檢測(cè)出1粒帶毒種子［37］。利用ACP-ELISA和TASELISA技術(shù)對(duì)CGMMV病毒進(jìn)行檢測(cè),其中ACPELISA可檢測(cè)到0.16 ng的純化病毒,而TASELISA可檢測(cè)到至少0.04 ng的病毒［34］。血清學(xué)方法由于操作簡(jiǎn)單,結(jié)果準(zhǔn)確,被廣泛應(yīng)用于各種病毒的檢測(cè),較適合田間大規(guī)模的鑒定。

3.4PCR檢測(cè)

隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,尤其是PCR技術(shù)的成熟,為黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測(cè)提供了更為靈敏高效的技術(shù)方法,包括RT-PCR,real-time PCR和IC-RT-PCR。目前,應(yīng)用較多的是RT-PCR技術(shù)。Liu等［35］利用CGMMV的CP蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物,對(duì)接種后的黃瓜葉片、花和種子進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)證明,CGMMV既可以通過(guò)受精的花朵進(jìn)行水平傳播,也可通過(guò)種子橫向傳播到下一代。另外,將PCR技術(shù)和熒光測(cè)定相結(jié)合的realtime PCR不僅可避免假陽(yáng)性的出現(xiàn),而且可提高檢測(cè)的靈敏度,進(jìn)行定量檢測(cè)。Chen等［38］利用多引物系統(tǒng)并結(jié)合靶向CGMMV 3’非編碼區(qū)的TaqMan探針,即real-time TaqMan RT-PCR技術(shù),對(duì)在中國(guó)搜集到的CGMMV的分離物進(jìn)行檢測(cè),可在黃瓜中檢測(cè)到至少0.13 pg的CGMMV。免疫捕捉RT-PCR (IC-RT-PCR)是1種抗原檢測(cè)系統(tǒng),將1段已知序列DNA片段標(biāo)記到抗原抗體復(fù)合物上,再用PCR方法將這段序列擴(kuò)增,然后用常規(guī)PCR方法檢測(cè)產(chǎn)物［10］。黃靜［31］利用IC-RT-PCR技術(shù),在接種后的黃瓜病葉、葫蘆病葉、南瓜病葉和莧色藜枯斑均得到與預(yù)期大小相一致的目的條帶。Shang等［34］利用IC-RT-PCR技術(shù)可檢測(cè)到0.1 pg的病毒含量,靈敏度極高。PCR檢測(cè)技術(shù)由于靈敏度高,結(jié)果可靠,已作為一種常規(guī)的檢測(cè)方法,對(duì)CGMMV病情的控制和預(yù)防起到重要的作用。

3.5FISH檢測(cè)

FISH的基本原理是將DNA (或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針?lè)肿犹禺愋越Y(jié)合來(lái)檢測(cè)DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對(duì)定量分析［39］。FISH已應(yīng)用于番茄金色花葉病毒(Tomato golden mosaic virus,TGMV)［40］、番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)和馬鈴薯葉片卷曲病毒(Potato leafroll virus)的檢測(cè)［41］。利用FISH技術(shù)在黃瓜和甜瓜的雄花中進(jìn)行CGMMV的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),花藥組織被CGMMV感染,而花粉顆粒未被感染,該發(fā)現(xiàn)對(duì)于CGMMV的防治,特別通過(guò)種子的病毒傳播具有重要的流行病學(xué)意義［42］。

4　葫蘆科CGMMV抗性的遺傳分析

目前,對(duì)CGMMV抗性的遺傳分析研究還較少。通過(guò)對(duì)R×R,R×MR,R×S,MR×MR,MR×S和S×S等抗性不同的15個(gè)甜瓜組合配置六世代(P1,P2,F1,F2,BC1和BC2)進(jìn)行遺傳分析,發(fā)現(xiàn)CGMMV的抗性遺傳主要由多基因控制并呈現(xiàn)隱性遺傳特點(diǎn),感病對(duì)抗病表現(xiàn)為不完全顯性;在這15個(gè)組合中,有10個(gè)組合存在互作;除Phoot×Harela外,所有存在互作的組合表現(xiàn)為重復(fù)上位作用; Kachri×Phoot (R×R)在F1表現(xiàn)為雜種優(yōu)勢(shì),F2表現(xiàn)為超親分離［43］。CGMMV抗性的雜種優(yōu)勢(shì)為配置雜交組合提高抗病性提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

5　葫蘆科CGMMV抗性的遺傳改良

5.1抗性材料篩選及種間雜交

通過(guò)對(duì)現(xiàn)有葫蘆科栽培種和野生種進(jìn)行接種鑒定,篩選具有抗(耐) CGMMV的種質(zhì)資源。Rajamony等［44］鑒定到4份CGMMV抗性的甜瓜材料,其中,Phoot和Kachri為非沙漠類(lèi)型,FM-1和FM-5為育種株系。對(duì)72份遺傳背景差異較大的甜瓜材料采用人工摩擦接種的方法進(jìn)行苗期CGMMV抗性鑒定,共鑒定到2份免疫材料(C.figarei和C.zeyheri)和8份高抗材料(PRM-6,FM1,Phoot,VRM-5-10A,VRM-5-10B,VRM-7-12A,VRM-31-1-2和VRM-29-1C)［45］。Mitsuhiro等［46］對(duì)主要來(lái)源于亞洲的20份甜瓜材料進(jìn)行CMV-B2和CGMMV-K摩擦接種,并結(jié)合DAS-ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其中4份材料抗CMV,未檢測(cè)到抗CGMMV的材料。這些研究為葫蘆科作物CGMMV抗原的尋找和篩選提供了參考。

由于野生材料具有栽培品種所不具備的重要特性,材料之間的遠(yuǎn)緣雜交對(duì)于品系的遺傳改良至關(guān)重要。C.anguria和C.zeyheri均屬于甜瓜亞屬野生種,對(duì)CGMMV表現(xiàn)為抗性［47］。利用C.anguria 和C.zeyheri種間雜交,選育抗CGMMV的品種［48］。Skálová等［49］通過(guò)胚和種子挽救技術(shù),獲得C.anguria和C.zeyheri的種間雜交植株。種間雜交為CGMMV抗性材料的獲得提供了基礎(chǔ)。

5.2基于基因工程的遺傳改良

轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Posttranscriptional gene silencing,PTGS)或RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA (dsRNA)啟動(dòng)的序列特異的mRNA降解過(guò)程［50］。長(zhǎng)鏈dsRNA被內(nèi)切酶切成小的干擾RNA (small interfering RNA,siRNA)［51］。這些siRNA形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC),進(jìn)而識(shí)別其互補(bǔ)的RNA并將其降解［52］。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制可被病毒誘導(dǎo),形成siRNA介導(dǎo)的病毒防御機(jī)制［53-54］。因此,將編碼病毒特異序列的dsRNA轉(zhuǎn)入寄主中可以誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生RNA沉默,進(jìn)而提高寄主的抗性［55］。

植物病毒早期的轉(zhuǎn)基因抗性植物多數(shù)是利用病毒的外殼蛋白。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將病毒的外殼蛋白(CGMMV-CP)轉(zhuǎn)入西瓜的砧木中,部分西瓜轉(zhuǎn)基因植株對(duì)CGMMV表現(xiàn)為抗性［56］。將西瓜銀色斑點(diǎn)病毒(watermelon silver mottle virus,WSMoV)的部分N端序列與黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)、西瓜花葉病毒(watermelon mosaic virus,WMV)的部分CP基因序列融合成嵌合載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入西瓜,其中2個(gè)株系對(duì)CMV,CGMMV和WMV均表現(xiàn)為抗性［57］。此外,運(yùn)動(dòng)蛋白基因也被用于培育抗CGMMV病毒的轉(zhuǎn)基因植物。將CGMMV運(yùn)動(dòng)蛋白基因的重復(fù)序列(DR-MP)在甜瓜中過(guò)表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株對(duì)CGMMV表現(xiàn)出較高的抗性,并且轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA的胞嘧啶出現(xiàn)甲基化的現(xiàn)象［58］。除外殼蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白外,復(fù)制酶基因也被用于培育抗病毒植物。將含有缺陷CMV的復(fù)制酶基因的反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)化煙草,轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生有效的CMV抗性,并且在轉(zhuǎn)基因植株接種病毒前后均有siRNAs的存在,表明抗性的產(chǎn)生是由RNA沉默導(dǎo)致的［59］。目前,還未見(jiàn)復(fù)制酶基因在葫蘆科植物應(yīng)用提高CGMMV抗性的相關(guān)報(bào)道。

5.3基于miRNAs測(cè)序和人工miRNAs的遺傳改良

miRNAs測(cè)序技術(shù)可獲得數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的讀數(shù),使其成為揭示miRNAs表達(dá)模式、鑒定低表達(dá)量及特異miRNAs的有效途徑。對(duì)接種CGMMV后10,30和50 d的黃瓜葉片進(jìn)行小RNA測(cè)序,鑒定到可能與CGMMV的脅迫響應(yīng)相關(guān)的8個(gè)novel miRNAs 和15個(gè)已知miRNAs。其中miRNA156通過(guò)調(diào)控其靶基因Csa6M091970.2和Csa6M091970.1參與微生物脅迫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞發(fā)育等過(guò)程; miR390 在CGMMV侵染過(guò)程中表達(dá)的延遲黃瓜的開(kāi)花時(shí)間,進(jìn)而影響果實(shí)的發(fā)育;此外,miR171c,miR172d和miR2673也與CGMMV的脅迫響應(yīng)有關(guān)［60］。這些小RNA及其靶基因?yàn)橹仓昕共⌒缘母牧继峁┝司€索和基礎(chǔ)。

人工miRNA (artifical microRNA)技術(shù)是利用內(nèi)源miRNA前體骨架,通過(guò)替換miRNA序列產(chǎn)生具有新功能的miRNA［61］。除調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)外,人工miRNAs還可抵抗病毒的侵染。利用人工miRNA沉默蕪菁黃化花葉病毒(TYMV)的沉默抑制蛋白P69和蕪菁花葉病毒(TuMV)的沉默抑制蛋白HC-Pro,轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)蕪菁黃化花葉病毒和蕪菁花葉病毒具有高水平抗性［62］。煙草中表達(dá)針對(duì)黃瓜花葉病毒(CMV)的2b蛋白的人工miRNA表現(xiàn)出對(duì)CMV的抗性,其抗性水平超過(guò)siRNA介導(dǎo)的抗病毒水平［63］。張曉輝［64］通過(guò)設(shè)計(jì)識(shí)別CMV的2a/2b區(qū)和基因組的3’UTR的2個(gè)人工miRNAs并在番茄中過(guò)表達(dá),轉(zhuǎn)基因番茄植株表現(xiàn)出高水平的CMV抗性,通過(guò)嫁接和多重病毒復(fù)合侵染試驗(yàn)表明抗性是持續(xù)穩(wěn)定的,且通過(guò)嫁接試驗(yàn)證明,人工miRNAs是一種細(xì)胞自主性的抗病毒分子。這為通過(guò)人工miRNA在葫蘆科植物中進(jìn)行抗CGMMV的研究提供了很有意義的參考。

6　問(wèn)題和展望

目前,對(duì)于葫蘆科作物CGMMV抗性的遺傳改良雖然取得一定進(jìn)展,但仍存在較多的問(wèn)題,如可直接用于育種的抗源材料較少;對(duì)CGMMV抗性遺傳規(guī)律的研究不深入;缺少CGMMV抗性基因的定位和用于輔助選育的分子標(biāo)記;基因工程主要利用CGMMV病毒的衣殼蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白,而對(duì)于抗病機(jī)制仍不甚明確。針對(duì)這種現(xiàn)狀,提出以下建議:加快對(duì)葫蘆科作物CGMMV抗源材料的篩選,并利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)將抗性基因轉(zhuǎn)入到育種材料中;開(kāi)展葫蘆科作物抗CGMMV QTLs定位和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā),分子標(biāo)記作為輔助選擇手段,可以提高抗病品種的選擇效率;進(jìn)行葫蘆科作物抗CGMMV的基因克隆,明確抗病的分子機(jī)制,并利用基因工程將抗性基因轉(zhuǎn)移到農(nóng)學(xué)性狀優(yōu)良的品種上。此外,還可利用組學(xué)如轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學(xué)和miRNAs測(cè)序等技術(shù)和方法進(jìn)行CGMMV的抗性改良。

除了利用傳統(tǒng)育種及分子育種對(duì)葫蘆科作物CGMMV抗性進(jìn)行遺傳改良之外,還需加強(qiáng)對(duì)CGMMV的預(yù)防和控制,如生產(chǎn)無(wú)病種子,加強(qiáng)種子檢疫、種子除害處理,做好田間管理和藥劑防治、土壤消毒及輪茬種植等策略,避免CGMMV的傳播和擴(kuò)散。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

通信作者:范 敏,E-mail:fanminfm@sina.com。

作者簡(jiǎn)介:孫玉燕(1986—),女,山東菏澤人,助理研究員,博士,研究方向西甜瓜遺傳育種,E-mail:syy1111@126.com。

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31572145; 31272188; 31301787);浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)(2012C12903-2-10)

收稿日期:2015-12-16

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.42

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0528-9017(2016)02-0240-08

文獻(xiàn)著錄格式:孫玉燕,牛曉偉,范敏.黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV及葫蘆科作物抗性遺傳改良研究進(jìn)展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,57 (2):240-247.