殼聚糖絮凝法精制補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒水提液的工藝研究

杜艷嬌 康琛 杜茂波 沈碩 李曼玲 梁麗娜 劉淑芝

摘要：目的 優(yōu)選殼聚糖精制補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒水提液的工藝。方法 以淫羊藿苷為指標(biāo)，應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定其含量，采用正交設(shè)計(jì)法考察加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)水提工藝的影響；以淫羊藿苷為指標(biāo)，結(jié)合總多糖含量，選擇藥液濃度、絮凝溫度、澄清劑加入量3個(gè)因素，優(yōu)選殼聚糖的絮凝澄清條件。結(jié)果 最佳水提工藝條件為A2B1C3，即加入10倍量水，提取3次，每次1 h；最佳絮凝工藝為A1B2C3，即藥液濃度為0.4 g/mL，絮凝溫度為40 ℃，殼聚糖加入量為0.1%。結(jié)論 本研究?jī)?yōu)選的精制工藝穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒；淫羊藿苷；殼聚糖；精制工藝；正交試驗(yàn)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.026

中圖分類號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）04-0098-04

Study on Refining Water Extract of Bushen Yangxue Granules by Chitosan Flocculation DU Yan-jiao1，2， KANG Chen2， DU Mao-bo2， SHEN Shuo2， LI Man-ling2， LIANG Li-na3， LIU Shu-zhi2 （1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China； 2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China； 3. Eye Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100040， China）

Abstract： Objective To optimize refinement of water extract from Bushen Yangxue Granules by chitosan flocculation. Methods According to the content of icariin detected by HPLC， the waters amount， extraction time and extraction times were evaluated by orthogonal design. The effects of the solution concentration， clarifying temperature and the amount of clarifying agent on the flocculation clarification processes were optimized with the content of icariin and polysaccharides. Results The optimum water extraction processes A2B1C3 were follows： 10 times amount of water， three times extraction and 1 h for each extraction process. The optimized flocculation clarification processes A1B2C3 were as follows： solution concentration was 0.4 g/mL， the clarifying temperature was 40 ℃ and the addition of chitosan was 0.1%. Conclusion The optimized refining process is stable and feasible.

Key words： Bushen Yangxue Granules； icariin； chitosan； refining process； orthogonal test

1 儀器與試藥

Waters Alliance高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），1515型檢測(cè)泵，2487型檢測(cè)器，717型自動(dòng)進(jìn)樣器；BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平，BSS210型萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；Agilent 8453E型紫外分光光度計(jì)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；HJ-6型六聯(lián)磁力加熱攪拌器（金壇市萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)0737-9508，中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用），無(wú)水葡萄糖（批號(hào)991122，北京化學(xué)試劑公司），苯酚（批號(hào)030805，北京化學(xué)試劑公司），乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，硫酸、乙醚均為分析純。處方藥材均購(gòu)自安徽亳州芳益堂。殼聚糖為藥用級(jí)（批號(hào)20131012，北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司），臨用前用1%醋酸加熱配成1%溶液[2]，放置24 h使其充分溶脹，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水（28∶72）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫35 ℃，理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取提取物干膏粉約0.2 g，精密稱定，置塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例分別稱取除淫羊藿外的其余藥味，按提取精制工藝制成缺淫羊藿的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成缺淫羊藿的陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 線性關(guān)系考察 按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣2、4、6、10、15、20 ?L，記錄淫羊藿苷峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=2.2×105X+55 471（r=0.999 7，n=6），表明淫羊藿苷在0.2～2 ?g與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 ?L，記錄淫羊藿苷峰面積，結(jié)果淫羊藿苷峰面積RSD=1.73%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣20 ?L，記錄淫羊藿苷峰的面積，結(jié)果淫羊藿苷平均含量為 1.218 mg/g原藥材，RSD=0.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣20 ?L，記錄淫羊藿苷的峰面積，結(jié)果淫羊藿苷峰面積RSD=0.98%，表明淫羊藿苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 空白試驗(yàn) 取陰性對(duì)照溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣20 ?L，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果表明，在淫羊藿苷的保留時(shí)間處無(wú)色譜蜂，說(shuō)明對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品6份，各精密加入淫羊藿苷對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表1，表明本法具有良好的回收率。

2.2 總多糖含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品25 mg，精密稱定，置250 mL量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無(wú)水葡萄糖0.1 mg）。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40 ℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄V A]，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=65.285X-0.052（r=0.998 7），線性范圍2.475～14.85 mg/L。

2.2.3 測(cè)定法 取本品粗粉約0.5 g，精密沉定，加乙醚100 mL，加熱回流1 h，靜置，放冷，小心棄去乙醚液，殘?jiān)B同濾紙置燒瓶中，加水150 mL，加熱回流2 h。趁熱過(guò)濾，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至250 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置具塞試管中，加水1.0 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法，自“各精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖質(zhì)量，計(jì)算，即得。

2.3 水提工藝優(yōu)化

根據(jù)浸提理論及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]，影響水提工藝的因素主要有加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等，故本試驗(yàn)選取加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）3個(gè)因素進(jìn)行考察。按L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，按處方比例稱取9份枸杞子等水提藥材，每份共70 g，置圓底燒瓶中，加熱回流，過(guò)濾，濾液經(jīng)水浴濃縮，真空干燥，得干膏，稱重，粉碎成干膏粉。以淫羊藿苷含量為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提工藝，因素水平見表2，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由直觀分析法可知，影響淫羊藿苷含量的主次順序?yàn)镃>B>A，即提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量，其中C因素是最主要因素；經(jīng)方差分析可知，A因素和B因素對(duì)提取工藝均無(wú)顯著影響（P>0.05），C因素對(duì)提取工藝具有顯著影響（P<0.05），故確定最佳工藝為A2B1C3，即加10倍量水，提取3次，每次1 h。

2.4 絮凝工藝優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，影響殼聚糖純化效果的因素主要有藥液濃度、絮凝溫度、殼聚糖加入量、藥液的pH值、放置時(shí)間，絮凝攪拌速度等。本試驗(yàn)選取藥液濃度（A）、絮凝溫度（B）、殼聚糖加入量（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素考察3個(gè)水平。稱取處方藥材540 g，置10000 mL圓底燒瓶中，按優(yōu)選出的最佳水提工藝條件進(jìn)行提取，即加入5400 mL水，加熱回流提取3次，每次1 h，過(guò)180目篩，合并濾液，將濾液濃縮至一定濃度，離心，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排將藥液濃縮至0.4、0.2、0.1 g/mL的溶液，測(cè)定淫羊藿苷含量及總多糖含量。因素水平見表5，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表6，方差分析見表7、表8。

由直觀分析法可知，RA>RB=RC，影響淫羊藿苷含量的主次順序?yàn)锳>B=C，即藥液濃度>絮凝溫度=殼聚糖加入量，其中A因素是最主要因素；經(jīng)方差分析可知，A、B、C因素對(duì)絮凝工藝均無(wú)顯著影響（P>0.05），故最佳工藝為A2B2C3，即藥液濃度為0.2 g/mL，絮凝溫度為40 ℃，殼聚糖加入量為0.1%。

由直觀分析可知，影響總多糖含量的主次順序?yàn)锳>B>C，即藥液濃度>絮凝溫度>殼聚糖加入量，其中A因素是最主要因素；經(jīng)方差分析可知，A因素對(duì)絮凝工藝有顯著影響（P<0.05），故確定最佳工藝為A1B2C3，即浸膏濃度為0.4 g/mL，絮凝溫度為40 ℃，殼聚糖加入量為0.1%。

綜上分析，由于以淫羊藿苷為含量指標(biāo)時(shí)，A因素對(duì)絮凝工藝無(wú)顯著影響（P>0.05），而考察總多糖含量時(shí)，A因素對(duì)絮凝工藝有顯著影響（P<0.05），故而最終確定最佳工藝為A1B2C3。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱取180 g水提藥材，按最佳提取工藝提取，水提液平均分成3份，按優(yōu)選的最佳絮凝工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表9。說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

本試驗(yàn)在淫羊藿苷含量測(cè)定流動(dòng)相選擇時(shí)，考察了乙腈-水（30∶70）和乙腈-水（28∶72）2種比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為乙腈-水（30∶70）時(shí)，陰性對(duì)照在淫羊藿苷保留時(shí)間處有干擾，而流動(dòng)相為乙腈-水（28∶72）時(shí)無(wú)干擾。

殼聚糖澄清劑法雖然具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但目前技術(shù)尚不成熟，在精制過(guò)程中或多或少會(huì)有殘留，雖然殼聚糖毒性低且具有良好的生物相容性，但其本身具有一定的藥理功效[10-11]，尚需進(jìn)一步探討。中藥復(fù)方水提液體系復(fù)雜，殼聚糖對(duì)水提液中各成分的影響亦有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張彤，徐蓮英，蔡貞貞.殼聚糖澄清劑精制中藥水提液的應(yīng)用前景[J].中國(guó)中藥雜志，2001，26（8）：516-519.

[2] 宋信莉.殼聚糖澄清劑法精制天麻鉤藤飲工藝的研究[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35（3）：314-316.

[3] 李海濱，呂佳.正交設(shè)計(jì)考察益腎康顆粒劑提取工藝[J].中醫(yī)藥學(xué)刊， 2006，24（7）：1361-1362.

[4] 武海燕，洪筱坤，沈謙，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選乳寧顆粒劑的水提與精制工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25（12）：1314-1316.

[5] 孔成福.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化淫黃顆粒的提取工藝[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32（4）：528-529.

[6] 劉起華，文謹(jǐn)，孫玉雯.正交試驗(yàn)法優(yōu)選補(bǔ)腎益髓顆粒提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（9）：8-11.

[7] 韓樂(lè)，孫曉海，韓偉.殼聚糖絮凝法精制合歡皮多糖水提液的工藝[J].生物加工過(guò)程，2014，12（2）：38-43.

[8] 陳英，李永吉，程淑云，等.殼聚糖絮凝法精制紅花水提液工藝的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（5）：1167-1168.

[9] 王勇，鄒韻，李永輝.正交試驗(yàn)優(yōu)選裸花紫珠水提液的殼聚糖絮凝澄清工藝[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，21（1）：7-13.

[10] 唐大川，楊紅.殼聚糖神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志， 2014，32（3）：281-284.

[11] 許劍峰.殼聚糖及其衍生物的藥理活性研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)， 2006，18（6）：13-15.

（收稿日期：2015-08-26）

（修回日期：2015-09-11；編輯：陳靜）

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