固液相色譜法同時檢測畜禽糞便抗生素的方法

王忠琴（輝南縣輝發城鎮畜牧獸醫站，吉林通化135100）

固液相色譜法同時檢測畜禽糞便抗生素的方法

王忠琴
（輝南縣輝發城鎮畜牧獸醫站，吉林通化135100）

目的：使用固相萃取——高效液相色譜法檢測畜禽糞便中的抗生素殘留。方法：使用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH=4.0）提取家禽糞便樣品，經HLB固相萃取小柱純化富集，以及高效液相色譜分離檢測。結果：3信倍噪比下四環素、氟喹諾酮氨磺二甲嘧啶的檢出限分別為0.20～7.20μg/kg、0.16～3.15μg/kg、0.05μg/kg，三種抗生素豬糞的加標回收率分別為60%～100%、41%～120%、94%～101%，雞糞的加標回收率分別為70%～101%、65%～99%、115%～120%，相對標準差均在2.5%～9.3%之間。結論：固液相色譜法具較高的準確度，可對禽糞便四環素、喹諾酮及磺胺二甲嘧啶類抗生素同時檢出。

家禽糞便；固相萃取；高效液相色譜

隨著社會的不斷發展，家禽養殖業也逐漸向現代化方向發展，規模化、集約化的養殖方式出現，使得抗生素家禽養殖中被廣泛應用［1］。而抗生素在家禽體內的吸收性差，約有 30% ～90%的抗生素會以原藥的形式隨著糞便從家禽體內排除［2］，對土壤及地表水源造成污染。因此需要對家禽糞便中抗生素予以分析檢測，以減少抗生素對環境的污染。筆者本次主要分析固液相色譜法同時對檢測畜禽糞便抗生素的方法，內容如下：

1　儀器與試劑

1.1儀器與試劑

HLB固相萃取柱、Visiprep TM-DL固相萃取裝置、WD-12氮吹儀、Agilent-1200高效液相色譜儀、ASE300加速溶劑萃取裝置；土霉素、四環素、金霉素、諾氟沙星、環丙沙星、諾美沙星；甲醇、乙腈（色譜純）檸檬酸、EDTA鈉鹽、NaOH等試劑為分析純，實驗用水為超純水。

1.2溶液配制

稱取各類所需抗生素1毫克分別裝入10毫升容量瓶中。使用甲醇溶解四環素類、磺胺類和大環內酯類抗生素。

1.3樣品采集與處理

采集新鮮家禽糞便（選擇本地區規模化家禽養殖場）樣品冷凍干燥后，粉碎過篩，在家禽糞便樣品中加入抗生素混合標準液，渦旋震蕩 1分鐘，常溫下超聲 20分鐘，4℃下 10000轉 /分鐘離心 10分鐘，取上清液 10毫升，重復上述步驟 2次，分別取上清液 10毫升、5毫升，將三次提取上清液混合后，取 5毫升予以超純水稀釋（甲醇含量＜10%），過固相萃取小柱，依次使用5毫升甲醇和5毫升 0.2mol檸檬酸溶液火化，將以上提取物以5毫升/分鐘流速過柱，依次使用10毫升 5%甲醇溶液和10毫升水沖洗HLB小柱，用 10毫升二氯甲烷洗脫目標抗生素，洗脫液在氮氣下吹干至 0.1毫升以下。加入 1μg內標物質 LOM，使用甲醇——水混合液定容至 1毫升，供HPLC-MS/NS檢定。

1.4色譜條件

采用InertsilODS-3色譜柱；流動相為乙腈（A）和1%乙酸（B），流速為 0.8毫升 /分鐘；柱溫 30℃；梯度洗脫程序：0～18分鐘，10%A；18～20分鐘，37%，80%A。

2　結果

分別在各類樣品中添加四環素類、喹諾酮類、硫胺二甲嘧啶類抗生素 1μg/g、5μg/g、10μg/g三個含量水平，結果顯示豬糞的加標回收率分別為 60%～100%、41%～120%、94%～101%，雞糞的加標回收率分別為 70%～101%、65%～99%、115%～120%。相對標準差均在2.5%～9.3%之間，說明檢測方法的準確性和精密度高。

3　討論

由于家禽糞便樣品復雜，含有蛋白質、碳水化合物、脂肪和各種無機成分，因此在對樣品進行選擇時要確保標準物的定量。而在凈化步驟中，對環境樣品中抗生素前處理，HLB為目前效果最佳的柱子［3］。在洗脫實驗中選擇二氯甲烷作為洗脫機，主要是由于二氯甲烷對金霉素的洗脫率好，且洗脫下來的雜質少，使色譜圖中的目標分離物和檢測不受干擾。

抗生素是一種可離子化的極性有機化合物，因此流動相的pH值對抗生素物質的分離和檢測非常重要，一般選擇有機溶劑和緩沖液按照一定比例混合，最常見的有機溶劑為乙腈和甲醇，其對紫外線的吸收率低，緩沖液選擇乙酸，主要是乙酸作為流動相的峰形好。過低的pH會降低色譜柱的使用范圍，一般緩沖液的pH值控制在2～3內，流動相選擇 1%乙酸（pH=2.6）。在檢測時選擇 270毫米作為檢測波長，主要使用270毫米檢測波長，對四環素、氟喹諾酮氨磺二甲嘧啶三種抗生素均具有較高的響應值，且分布相對均勻。

綜上所述：固液相色譜法具較高的準確度，可對禽糞便四環素、喹諾酮及磺胺二甲嘧啶類抗生素同時檢出。

［1］李艷霞，李帷，張雪蓮，等.固相萃取4高效液相色譜法同時檢測畜禽糞便中 14種獸藥抗生素 ［J］.分析化學研究報告，2012，40（02）：213-217.

［2］王麗，鐘冬蓮，陳光才，等.固相萃取——高效液相色譜——串聯質譜法測定畜禽糞便中的殘留抗生素 ［J］.色譜，2013，31（10）：1010-1015.

［3］張敏，劉慶玉，敖永華.高效液相色譜——熒光檢測畜禽糞污中四種氟喹諾酮類抗生素殘留［J］.湖北農業科學，2012，51 （03）：602-604.

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ADOI編號：10.14025/j.cnki.jlny.2016.17.026

王忠琴，大專學歷，輝南縣輝發城鎮畜牧獸醫站，獸醫師，研究方向：動物檢疫。