抗菌肽的研究進展及其應(yīng)用

車媛媛查向東勞泰財趙大偉

（1.廣東希普生物科技股份有限公司，廣東 廣州510000;2.安徽大學，安徽合肥230000）

抗菌肽的研究進展及其應(yīng)用

車媛媛1查向東2勞泰財1趙大偉1

（1.廣東希普生物科技股份有限公司，廣東 廣州510000;2.安徽大學，安徽合肥230000）

抗菌肽又稱抗微生物肽，是生物體先天免疫的重要組成成分，具有廣譜的抗菌作用，是一類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質(zhì)。由于抗菌肽對細菌、真菌、原蟲、病毒、腫瘤細胞等有著廣泛的抑制作用，無致耐藥性。隨著病原微生物對抗生素的耐藥性日益加劇，使得抗菌肽在醫(yī)藥行業(yè)和飼料添加劑等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。本文綜合近年來抗菌肽的研究，概述了抗菌肽的來源、功能、作用機制和在畜牧業(yè)上的應(yīng)用前景。

抗菌肽；來源；生物活性；應(yīng)用

抗菌肽 (Antibacterial Peptide)又叫抗微生物肽(Antimicrobial Peptides)，是由多種生物細胞特定基因編碼經(jīng)外界條件誘導產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細菌、真菌、病毒、原蟲，抑殺腫瘤細胞等活性作用的多肽。由于抗生素的廣泛使用導致了微生物耐藥性，新型抗菌藥物研發(fā)成為近年研究熱點，而抗菌肽是生物天然免疫重要的效應(yīng)分子，具有調(diào)節(jié)宿主免疫的作用，所以有極大的臨床應(yīng)用潛力。目前已有2200多種的抗菌肽，來源有細菌、真菌、人體、昆蟲等，其中有些抗菌肽的基因序列已得到測定。抗菌肽具有多種優(yōu)點，如無毒副作用（僅少數(shù)種類具有溶血活性）、無污染、無殘留，難以產(chǎn)生耐藥性，能抑制癌細胞擴增，調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)、抗炎功能，已經(jīng)成為近些年來生物學及藥學領(lǐng)域研究的熱點。

1 抗菌肽的來源

1.1 來源于昆蟲的抗菌肽

昆蟲家族抗菌肽的一個典型例子就是天蠶素（cecropins），包括天蠶素A、B、C、D、E5種結(jié)構(gòu)。天蠶素具有廣譜抗菌活性，其作用機理是天蠶素抗菌肽分子可以在細菌細胞膜上穿孔后形成離子孔道，造成細菌細胞膜結(jié)構(gòu)破壞而發(fā)揮抑菌作用。它們的分子中不含半胱氨酸，呈線性α-螺旋結(jié)構(gòu)，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有較強活性，并且所有昆蟲抗菌肽的C端都被酰胺化，這一性質(zhì)對其廣譜抗菌性極為重要。

昆蟲抗菌肽的另一大家族是昆蟲防御素(insect defensins)。所有昆蟲防御素均帶一個凈的正電荷，都含有6個Cys并形成3個分子內(nèi)二硫鍵，呈反平行β-折疊結(jié)構(gòu)。昆蟲防御素對革蘭氏陰性菌的抗菌活性較弱，且對真核細胞和真菌不起作用，但可以抗革蘭氏陽性菌。

除以上兩種，還有多種昆蟲抗菌肽，如來自蜜蜂的apidaecin和abaecin，來自天蠶H.cecropia的attacin A-F，來自家蠶B.mori的moricin。

1.2 來源于植物的抗菌肽

自第一種植物抗菌肽（Triticumaestivum）從禾本科植物小麥中被分離出以來，至今已有多種有活性的植物抗菌肽被發(fā)現(xiàn)并鑒定，除了硫堇蛋白( Thionins)，還有環(huán)蛋白、富含甘氨酸的蛋白、snakins和hevein狀蛋白。硫堇蛋白是一類分子量約5kD、氨基酸殘基數(shù)45～47、富含半胱氨酸的堿性蛋白。近來研究表明，硫堇蛋白能抑制多種病原細菌（如革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌）及真菌的生長。

目前關(guān)于防御素的研究是最多的，細胞防御素（Defensin）對許多種細菌有抑制作用，尤其能抑制病原體的增殖。不同種類的植物防御素的一級結(jié)構(gòu)呈多樣性，氨基酸組成相差較大，高含量的Cys形成穩(wěn)定的二硫鍵，可能與其生物學特異性功能相關(guān)。然而某些抗菌肽，如椰汁中以及石榴種子中富含甘氨酸的肽，只有多個正電荷不含二硫鍵。目前，已分離的大多數(shù)植物防御素都有抗真菌或抗病毒特性，如NP-1可在幾分鐘內(nèi)以低劑量濃度殺滅真菌C.albicans。

1.3 來源于動物的抗菌肽

抗菌肽起初是在無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的，隨后在脊椎動物中也有發(fā)現(xiàn)，這些肽顯示出多樣的序列結(jié)構(gòu)和特異性的靶標。基因編碼的抗菌肽能夠在哺乳動物、兩棲動物、魚類、昆蟲等多種不同生物體的組織中表達。根據(jù)結(jié)構(gòu)與生物學功能將動物抗菌肽分為防御素和cathelicidins。防御素含3～4對分子內(nèi)二硫鍵，已經(jīng)從不同物種中分離出了80多種防御素：包括α-防御素、β-防御素和θ-防御素。從豬小腸中純化的抗菌肽NK-lysin，含有78個氨基酸殘基，其分子量為8924 Da，對大腸桿菌、巨大芽孢桿菌、化膿鏈狀菌、NK-敏感型小鼠腫瘤細胞YAC-1有顯著裂解活性。Cathelicidins是一類高效殺死細菌和真菌、具有廣抗菌譜的抗菌肽。防御素和cathelicidins通過抵擋致病菌入侵而為宿主提供了第一道防線，其中一些多肽對未分化的淋巴細胞、樹突狀細胞有趨化性，另外還可以誘導細胞因子生成、肥大細胞脫粒等。

1.4 來源于微生物基因工程的抗菌肽

利用基因工程重組技術(shù)異源表達系統(tǒng)來生產(chǎn)抗菌肽是一種新模式，其中，大腸桿菌是生產(chǎn)抗菌肽良好的表達系統(tǒng)，但是這種表達系統(tǒng)可能會表達異源成分的毒性而對宿主本身造成侵害，導致表達水平低下。利用甲基畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)異源性的蛋白質(zhì)，采用補料高密度培養(yǎng)方法，濕菌體濃度高達25%以上，異源蛋白分泌在細胞外，有良好的表達效果，發(fā)酵液的后處理比較容易。

1.5 來源于人工合成的抗菌肽

近年來，隨著人們對抗菌肽研究的深入，科研人員嘗試人工合成抗菌肽，并在醫(yī)療應(yīng)用方面取得了一定的成果。利用抗菌肽研制的藥物已進入市場，如：美國馬蓋寧制藥公司研發(fā)出來的馬蓋寧( magainin)藥物可殺死病毒和腫瘤細胞，柞蠶抗菌肽能夠抑制乙型肝炎和殺滅腫瘤細胞，在醫(yī)藥上已制成腎肝寧膠囊治療腎炎及肝炎等。Sang等（2007）化學合成了一種新的抗菌肽cathelicidin（K9CATH），含172個氨基酸殘基，合成的抗菌肽具有廣泛的抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母的活性。

2 抗菌肽的生物活性

2.1 抗細菌活性

大量研究表明，抗菌肽具有廣譜的抗細菌活性，能夠抑制或殺滅多種革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌。但不同抗菌肽的抗菌活性存在較大差異，抗菌譜亦明顯不同。如家蠶抗菌肽的7大家族：cecropins、moricins、attacins、lebocins、enbocins、gloverins及defensins，每個家族中的抗菌肽抗菌活性和抗菌譜均不相同。

2.2 抗病毒活性

很多抗菌肽具有抗病毒活性，這些病毒都擁有膜結(jié)構(gòu)。目前研究表明，抗菌肽主要通過3種機制發(fā)揮抗病毒作用。第一種是與病毒的包膜結(jié)合而起作用，如α-防御素對皰疹病毒的作用，美洲鱟素對人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)病毒的作用；第二種是抑制病毒繁殖，如天蠶素A和蜂毒素在亞毒性濃度下可以通過阻遏基因的表達來抑制HIV-1病毒增殖；第三種是干擾病毒的組裝，如蜂毒素被當作病毒包被蛋白，被病毒RNA結(jié)合后，導致RNA結(jié)構(gòu)改變，不能和正常蛋白質(zhì)結(jié)合，從而病毒無法正常組裝。

2.3 抗真菌活性

許多抗菌肽具有良好的抗真菌作用，Mg2+、Ca2+及溫度均會影響其抗真菌能力。用天蠶素A和蜂毒素分子的基因片段，合成雜合肽CA-ME。雜合肽可使真菌孢子原生質(zhì)體的細胞壁無法恢復，無法維持細胞的正常形態(tài)，雜合肽使細胞膜形成孔洞從而達到殺菌目的。人和靈長類動物唾液的組蛋白亦有抗真菌活性，它與細胞的包膜受體結(jié)合后進入細胞內(nèi)并定位于線粒體。

2.4 抗寄生蟲和原蟲活性

抗菌肽對寄生蟲、原蟲等具有殺傷作用，可以有效地殺滅寄生于人類或動物體內(nèi)的寄生蟲和原蟲，如瘧原蟲孢子、變形蟲和四膜蟲等。抗菌肽的靶標是寄生蟲的質(zhì)膜，間接引起細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和細胞器的改變，干擾細胞正常代謝。Cecropins的類似物shiva-1和蛙皮抗菌肽蛙素可以有效殺死瘧原蟲，蛔蟲體內(nèi)的抗菌肽可殺滅利什曼鞭毛蟲，柞蠶抗菌肽cecropins D對引導毛滴蟲亦有很好的殺傷作用。

2.5 抗腫瘤活性

抗菌肽對腫瘤細胞有廣譜的殺滅作用，腫瘤細胞外膜含有較高的酸性磷脂成分，細胞骨架系統(tǒng)不完善，腫瘤細胞相對于正常細胞對抗菌肽的敏感度高。蜂毒素、天蠶素A、爪蛙素和α-防御素-1/2對癌細胞具有選擇性殺傷作用。Mai等發(fā)現(xiàn),抗菌肽DP1可以迅速誘導腫瘤細胞凋亡。

3 抗菌肽的抑菌機理

近來研究表明：抗菌活性不依賴于具體的氨基酸序列或具體的抗菌肽的結(jié)構(gòu)，而是由某一種肽的氨基酸組成及其自身的理化性質(zhì)決定的，眾多抗菌肽的作用機制可能有助于解釋其廣譜抗菌活性及罕見的誘導抗性。從目前的研究成果來看，許多研究認為抗菌肽作用在細菌細胞質(zhì)膜上形成孔，破壞其細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，導致胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，最終導致細菌死亡。另一部分研究認為，抗菌肽分子作用于細胞內(nèi)物質(zhì)，阻礙蛋白質(zhì)和DNA的合成，破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，阻止其行使正常的生物學功能。多數(shù)人傾向于第一種解釋。

對于抗菌肽分子作用在細胞質(zhì)膜是如何形成孔道，認為有以下三種模型。

3.1 桶-板模型（Barrel-stave model）

該模型認為抗菌肽分子插在細胞膜內(nèi)，垂直排列形成木桶側(cè)板狀孔道，其疏水基團與磷脂膜相互作用，親水基團面向內(nèi)部形成一個桶狀的離子通道，胞內(nèi)物質(zhì)外泄導致細胞死亡。一般認為，陽離子抗菌肽能夠形成這種離子通道，這些抗菌肽多含有α-螺旋和（或）β-折疊結(jié)構(gòu)。當抗菌肽以單體形式存在時，在低濃度下相互識別，待濃度達到臨界值時，慢慢形成多聚體，最終形成桶-板結(jié)構(gòu)。

圖1 抗菌肽的抗菌機制模型

3.2 環(huán)孔模型（Tordial-pore model）

與桶-板模型不同，這種模型中抗菌肽垂直插入細胞膜，形成親水孔道，引入水分子，從而使脂質(zhì)分子的排列方向發(fā)生改變。肽分子親水基團與磷脂分子的親水部分相結(jié)合，疏水基團面向脂質(zhì)核心，以螺旋環(huán)狀在細胞膜內(nèi)形成連續(xù)環(huán)形孔道。

3.3 地毯模型（Carpet Model）

這種模型中的抗菌肽在靜電作用下與帶有陰離子的磷脂頭部基團相結(jié)合，不插入到細胞膜內(nèi)而是與脂雙層表面互相平行，疏水基團面向磷脂膜、親水面朝向溶液，類似地毯覆蓋在細胞膜表面。當肽分子達到一定濃度時，會破壞細胞膜成微團狀，使細胞內(nèi)容物外泄，膜電勢發(fā)生改變，最終導致細胞死亡。

4 抗菌肽在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

4.1 作為飼料添加劑應(yīng)用

應(yīng)用基因工程手段大量生產(chǎn)抗菌肽，并將其作為飼料添加劑可以使飼養(yǎng)動物對外源致病菌具有更好的抵抗力。抗菌肽具有良好的加工特性，能耐100℃高溫、適宜pH2.5～9、貯藏穩(wěn)定性高、配伍協(xié)助性高等。在發(fā)酵結(jié)束后進行高溫濃縮處理時，工程菌菌體被充分殺滅而抗菌肽本身卻不會失活。抗菌肽具有獨特的殺菌機制，病原菌不易對其產(chǎn)生耐藥性。因此，畜牧行業(yè)中，抗菌肽作為飼料添加劑是目前飼料工業(yè)發(fā)展的一個新的研究方向。但目前在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用鮮有報道，只有少數(shù)相關(guān)試驗研究。溫劉發(fā)等（2001）用甲醇誘導啟動子AXO1成功表達抗菌肽基因，并分泌到菌體外，經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化獲得的抗菌肽活力達5600 U/mL。這些酵母發(fā)酵液以飲用水攝入計量為60U/（只·天）的粵黃雞飼養(yǎng)試驗。結(jié)果表明，抗菌肽可促進小雞生長和減少排泄物氮含量。侯振平等（2011）、Tang等（2009）、潘行正等（2010）發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加抗菌肽能夠增加腸道益生菌數(shù)量，控制腹瀉率，提高仔豬生長性能，從而提高成活率。

4.2 提高動物生產(chǎn)性能

飼料中添加適量的抗菌肽，能夠使飼料的利用率提高，進而促進動物的生長。陳香等（2011）通過對斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加天蠶素代替抗生素，對仔豬的生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率等進行了比較，結(jié)果表明天蠶素對仔豬生長性能有一定的促進作用，并且能顯著改善飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本。關(guān)靜姝等（2015）在1日齡健康肉雞日糧中添加腸桿菌肽抗菌肽300 mg·kg-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與不飼喂抗菌肽的對照組相比，飼喂抗菌肽肉雞出欄體重和平均日增重均增加，死亡率降低69%，同時也提高飼料的轉(zhuǎn)化率，改善動物的生產(chǎn)性能。張江（2015）等利用微生態(tài)制劑與天蠶素抗菌肽復合產(chǎn)品飼喂奶牛，試驗發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)日糧中添加微生態(tài)和抗菌肽復合制劑，可提高奶牛平均產(chǎn)奶量1.5kg，體細胞降幅達60%。陳曉生等（2005）于肉鴨日糧中添加液體的蠶抗菌肽AD-酵母制劑發(fā)現(xiàn)，血清代謝激素的活動顯著增強，IGF-1濃度升高，營養(yǎng)物質(zhì)合成加強；甲狀腺素T3升高，脂肪、T4降低；尿素氮濃度顯著降低，體內(nèi)氮排出減少。

4.3 提高動物抗病能力

在抗菌肽作用機理的基礎(chǔ)研究中人們觀察到其對機體免疫功能產(chǎn)生的重要作用，而進一步的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽作為飼料添加劑也可以提高動物的免疫能力。利用抗菌肽的抗菌、殺菌作用，在飼料中添加抗菌肽可以提高動物的免疫力和抗病能力。Marel等（2012）研究表明，在飼料中添加β-葡聚糖可以顯著提高鯉魚皮膚中β防御素1和β防御素2及鰓中β防御素的表達量，說明β-葡聚糖可能是通過影響鯉魚黏膜系統(tǒng)來提高抗菌肽基因表達，從而提高鯉魚的免疫力。

5 結(jié)語

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，對抗菌肽的研究也越來越深入。一是在分子水平上研究抗菌肽在動物免疫防御系統(tǒng)中的合成過程及其調(diào)控機制，二是探討抗菌肽的藥用開發(fā)價值。抗菌肽具有廣譜的抗菌作用，具有促生長和治療疾病的功能，不會產(chǎn)生耐藥性，具有安全、無毒副作用的生物學特性，可作為一種綠色飼料產(chǎn)品。利用微生物大規(guī)模、高效生產(chǎn)抗菌肽，并且應(yīng)用到動物生產(chǎn)中，不僅能為養(yǎng)殖業(yè)帶來一定的經(jīng)濟效益，而且還保障了動物源性食品安全，促進養(yǎng)殖業(yè)向綠色無公害方向發(fā)展。

（略）

S816.7

A

1005-8613（2016）12-0034-04

2016-9-26