采用唾液淀粉酶活性指標對脾虛模型大鼠唾液采集方法的評價研究*

林 靜，盧 群，楊澤民△

(1.廣東藥科大學基礎學院，廣州 510006;2.嘉應學院醫學院，廣東 梅州 514031)

采用唾液淀粉酶活性指標對脾虛模型大鼠唾液采集方法的評價研究*

林 靜1，2，盧 群1，楊澤民1△

(1.廣東藥科大學基礎學院，廣州 510006;2.嘉應學院醫學院，廣東 梅州 514031)

目的:評價脾虛模型大鼠唾液采集方法的可行性。方法:采集利血平所致脾虛組大鼠和正常組大鼠各24例酸刺激前后的唾液，其中刺激后的唾液以0.4 mol/l 0.50 cm×0.50 cm檸檬酸濾紙，每隔2.5 min刺激大鼠舌尖30 s，獲得刺激后0～5 min、6～10 min和11～15 min的唾液。Bernfeld法測定唾液淀粉酶(sAA)活性，計算sAA活性比值。結果:脾虛組衰竭明顯，體質量比正常組顯著降低;正常組與分組前所有大鼠刺激前和刺激后sAA活性及其活性比值比較差異無統計學意義;脾虛組酸刺激前的sAA活性與正常組比較差異無統計學意義，酸刺激后3個時間段的sAA活性和活性比值均比正常組顯著降低。結論:建立唾液采集方法經sAA活性分析，表現出與人較為一致的趨勢，可以用于脾虛大鼠sAA相關研究。

唾液淀粉酶;酸刺激;脾虛大鼠;唾液采集

中醫認為“脾開竅于口”、“脾主涎”、“脾在液為涎”等，涎為口腔津液，是唾液中較清稀的部分，具有潤澤口腔、保護口腔黏膜的作用，在受到刺激如進食時分泌量增多，以助食物吞咽和消化吸收，脾胃調和時唾液分泌適量。在論述脾的病理時，把“多流涎”作為脾虛證重要的證候之一。另外，從臨床辨證、治療等方面均發現，脾與唾液關系密切。唾液淀粉酶(sAA)作為唾液中最為豐富的蛋白［1］，常被用來作為考察唾液蛋白分泌的主要指標。臨床研究顯示，檸檬酸刺激后健康人和脾虛患者sAA活性均增加，但脾虛患者 sAA活性比值比健康人顯著下降，這一結果作為脾虛證臨床辨證的一項重要參考指標，已被廣泛認可和驗證［2-7］。然而動物研究結果卻顯示，脾虛大鼠和正常大鼠酸刺激后sAA活性均下降，脾虛大鼠 sAA活性比值比正常大鼠顯著降低［8-10］。動物實驗結果與臨床結果存在較大差異的原因，可能與唾液的采集方式和唾液的來源有關。臨床常采用自然流出的方式獲得全唾液，而動物實驗以采用注射針頭抽取腮腺唾液為主要方法。本研究參考課題組前期建立的人唾液采集方法［11］，采集正常大鼠和脾虛大鼠酸刺激前后的全唾液，比較兩者sAA活性，對復制的脾虛大鼠模型和唾液采集方法進行評估。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠，體質量230～250 g，由廣州中醫藥大學動物中心提供(許可證號SCXK(粵)2013-0020，質量合格證號44005900001102)。

1.2 試劑與儀器

利血平注射劑(廣東邦民制藥有限公司，批號121112);1%戊巴比妥鈉:稱取戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司，德國進口分裝，批號020402，Q/H82-F158-2002)1.0 g，用蒸餾水溶解定容至100 ml，配制成1%戊巴比妥鈉溶液，室溫保存;檸檬酸(廣東汕頭市西隴化工廠，批號0601112);可溶淀粉(天津市大茂化學試劑廠);sAA活性測定試劑包括磷酸鹽緩沖液、底物溶液、麥芽糖溶液、顯色劑溶液均按參考文獻配制［12］;高速冷凍離心機(KDC-220HR，中佳ZONKIA)。

1.3 動物分組與造模

SD大鼠飼養環境為 SPF級隔離環境(許可證號SYXK(粵)2012-0125，動物實驗證號00066406)，飼養動物房溫度控制在21℃，濕度58%左右。4只一籠分開飼養，自由供水與飼料。分組前對 SD大鼠48例進行酸刺激前后取樣。取樣后將大鼠按隨機數字表法分為脾虛組和正常組各24只。脾虛組按0.4 mg·kg－1·d－1連續10 d皮下注射利血平，正常組按每只0.2 ml·d－1皮下注射生理鹽水。第11天采集刺激前后的大鼠唾液樣本，用以檢測sAA活性。從脾虛組中隨機選取大鼠10只，第11天繼續注射利血平至第14天，觀察利血平致大鼠衰竭情況。

1.4 檸檬酸濾紙的制作

0.4 mol/L 0.50 cm×0.50 cm的檸檬酸濾紙制作:配制預定濃度的檸檬酸溶液，待溶液穩定后倒入培養皿中，再將預定大小的濾紙放入培養皿中，浸泡10 min后取出，50℃烘干或室溫晾干備用。

1.5 唾液樣本的采集與保存

采樣前大鼠禁食不禁水12 h，取樣時間為7∶30～11∶30 am。所有大鼠稱重，1%戊巴比妥鈉溶液按30 mg·kg－1劑量腹腔注射麻醉，平臥固定。

1.5.1 刺激前唾液樣本采集 在大鼠半麻醉狀態下，用橡皮筋撐開大鼠上下顎，將移液槍伸到大鼠舌下，慢慢抽吸舌下腔內來自各唾液腺體的全唾液，采集約100 μL唾液樣本并記錄采樣時間。

1.5.2 酸刺激后唾液樣本的采集 用備好的檸檬酸濾紙刺激大鼠舌尖30 s，采集酸刺激后分泌的全唾液，間隔2.5 min后再次刺激30 s，將2次采集的唾液放于同一個 EP管中，即獲得刺激后0～5 min的唾液;再用相同的方法分別獲得刺激后6～10 min以及11～15 min的唾液，分別記錄3個EP管內的唾液量。

1.5.3 唾液樣本的保存 將采集的酸刺激前后唾液樣本4℃、10000 rpm/min，離心5 min去掉黏蛋白，將上清轉移至另一干凈的 EP管，－20℃保存待測活性。

1.6 Bernfeld法測定大鼠唾液sAA活性

參照文獻［12］方法稍加調整，取 50倍稀釋的唾液樣本0.5 ml加至含1 ml淀粉溶液中，37℃水浴3 min，加入 1 ml 3，5-二硝基水楊酸顯色 3 min，再100℃水浴5 min后用流水冷卻，加9.0 ml蒸餾水稀釋。用S22可見光分光光度計(上海棱光)測定各管波長540 nm下的吸光度值，通過麥芽糖標準曲線以及各管的吸光度值，計算出各管的 sAA酶活性(U/ml)。

1.7 統計學方法

以酸刺激前后的 sAA活性計算兩者的比值，sAA活性比值=酸刺激后sAA活性/酸刺激前sAA活性。采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，酸刺激前后比較采用配對 t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義;組間比較采用非配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體質量情況

圖1顯示，皮下連續注射10 d后，脾虛組大鼠體質量明顯下降，正常組大鼠體質量則平緩上升，分組前2組大鼠體質量比較差異無統計學意義(P＞0.05)，10 d后脾虛組大鼠體質量顯著降低(P＜0.01)。

2.2 大鼠一般情況

脾虛組大鼠在利血平注射的第2天，部分大鼠出現眼瞼下垂、瞳孔縮小;第3天部分大鼠大便溏稀，胃腸道活動明顯加快。連續注射11 d后，脾虛組大鼠扎堆、弓背、活動減少、雙目懶睜、大便溏軟、毛色不澤、食量下降，正常組大鼠毛色光澤、活動和進食均無異常。

脾虛組中隨機選取10只大鼠，在連續注射利血平的第13天死亡2只，第14天死亡4只，第14天停止注射，第15天繼續死亡2只，僅存活2只。死亡大鼠過度衰竭，皮肉快速腐爛。

2.3 各組刺激前后sAA活性和活性比值比較

表1顯示，正常組大鼠與分組前全體大鼠酸刺激前后sAA活性組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，并呈現一致的變化趨勢，即酸刺激后3個時間段的sAA活性比刺激前顯著增加，而刺激后3個時間段的 sAA活性比較差異無統計學意義(P＞0.05);脾虛組大鼠刺激前 sAA與前2組比較差異無統計學意義，刺激后3個時間段的sAA活性比刺激前雖有升高趨勢但無統計學意義(P＞0.05)，并比前2組顯著降低(P＜0.05)。

圖2顯示，正常組大鼠與分組前全體大鼠刺激后3個時間段的sAA活性比值組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，并呈現一致的變化趨勢，即數值都在3～4之間，且刺激后3個時間段的 sAA活性比值差異無統計學意義(P＞0.05)。然而脾虛組大鼠刺激后3個時間段的 sAA活性比值差異無統計學意義，都在1.2～1.3之間，但都顯著低于前2組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠酸刺激前后sAA活性(±s，U/ml)

表1 各組大鼠酸刺激前后sAA活性(±s，U/ml)

注:與本組刺激前比較:＊＊P＜0.01;與脾虛組同一采集時期比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組11～15 min sAA分 組 前 全 體 大 鼠 48 34.63±4.15 73.31±7.05＊＊# 86.17±7.71＊＊## 87.26±7.72＊＊##別 鼠數 刺激前sAA 刺激后0～5 min sAA 刺激后6～10 min sAA 刺激后脾 虛 組 24 40.15±6.21 46.42±5.87 50.54±8.39 50.69±9.70正 常 組 24 27.00±3.75 70.79±8.47＊＊# 78.31±8.93＊＊# 80.12±9.81＊＊#

圖2 分組前全體大鼠、脾虛組和正常組的sAA活性比值

3 討論

利血平致脾虛模型是脾氣虛證的常用造模方法。利血平屬于外周交感神經阻滯藥，能夠耗竭動物體內的兒茶酚胺類物質，使動物出現交感神經功能低下，副交感神經功能相對亢進，引發機體代謝功能下降，如體質量減輕、腹瀉、耐寒力差等［13］，動物所表現的這一系列癥狀和體征與中醫脾氣虛證患者有相似之處。本研究選擇6～7周齡、體質量250 g左右大鼠，按0.4 mg·kg－1·d－1的利血平濃度皮下連續注射10 d成功復制出脾虛大鼠模型。部分文獻［8-10］建議選擇(300 g±20)g大鼠，但這種大鼠飼養時間超過10周，可能已經趨于老齡化，代謝速度減慢且個體差異大，會影響唾液和 sAA的分泌;對于藥物濃度過低會延長成模時間［14］，過高雖然可以縮短成模時間，但會導致大鼠過早死亡［15］。本研究選擇了一個適中的藥物濃度，獲得了較好的效果，同時也發現即使是一個適中的藥物濃度，注射時間過長也會導致實驗動物的大量死亡。

脾虛證患者檸檬酸刺激前后的 sAA活性比值較正常人顯著下降，這一結果已被廣泛認可并驗證。本研究結果顯示，正常組大鼠酸刺激后sAA活性顯著增加，而脾虛組大鼠增加并不明顯，且脾虛組大鼠刺激前后的sAA活性比值比正常組大鼠顯著降低。該結果與脾虛證患者存在一致的趨勢。

Ekstr?m通過外科解剖將導管插入腮腺腺管口研究大鼠sAA對味覺刺激的反應，發現大鼠接受抗壞血酸刺激后其腮腺 sAA活性顯著增加。但是本研究結果與李燦［8］、林傳權等［9-10］報道的結果不一致。他們通過直接從唾液腺的開口處采集腮腺分泌唾液的方式，研究10%的醋酸刺激對大鼠唾液分泌的影響，結果顯示脾虛大鼠酸刺激前后唾液sAA活性比值比正常組大鼠顯著降低，而2組大鼠酸刺激后sAA活性都顯著降低。對于大鼠 sAA活性對刺激物的反應存在差異的原因，可能與刺激物的種類、唾液來源、采集方式以及大鼠的周齡選擇等有關。本研究參考臨床脾虛證患者唾液采集方法，選擇成年250 g左右大鼠采用適合大鼠舌頭大小的 0.4 mol/L 0.50 cm×0.50 cm的檸檬酸濾紙，間隔2.5 min刺激大鼠舌尖30 s，以5 min作為一個時間段，采集刺激后3個時間段的全唾液標本，酸刺激前后sAA活性及其比值分析結果與臨床脾虛證患者的sAA活性結果呈現一致的變化趨勢。因此，本研究的唾液采集方法能夠很好地反映大鼠對酸刺激的應激水平，具有簡便、無損傷、結果可靠等特點，非常適合用于以sAA活性作為觀測指標的脾虛模型動物的相關研究。

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Evaluation of Saliva Collection Method in Rat Model of Spleen-deficiency by Using Salivary Alpha-amylase Activity Index

LIN Jing2，LU Qun1，YANG Ze-min1△
(1.School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China; 2.Medical College of Jiaying University，Guangdong Meizhou 514031，China)

Objective To evaluate the feasibility of saliva collection method in rats with spleen-deficiency.Method Salivary samples from spleen-deficiency rats(n=24)induced by reserpine and normal rats(n=24)were collected before and after acid stimulation.Stimulated saliva of 0-5 min，6-10 min and 11-15 min were collected by putting 0.4 mol/l 0.50 ×0.50 cm of citric acid filter paper at the tongue tip 30 s every 2.5 min.Salivary alpha-amylase(sAA)activity was determined by the Bernfeld method，and sAA activity ratio was calculated.Result:Spleen-deficiency rats collapsed severely and their weight showed significantly lower than the normal rats.The sAA activity and sAA activity ratios had no significant difference between normal rats and all rats before be grouped.There was no significant difference in unstimulated sAA activity between spleen-deficiency and normal rats，while spleen-deficiency rats had lower sAA activity and sAA activity ratio in stimulated saliva of three time periods than normal rats.Conclusion Saliva collection method established by the present study，by which sAA activity and sAA activity ratio in rat showed similar trend with that of human，could be used in the research of spleen-deficiency rats related with sAA.

Salivary alpha-amylase;Acid stimulation;Spleen-deficiency rats;Saliva collection

R285.5

:B

:1006-3250(2016)07-0909-03

2015-11-21

國家自然科學基金資助項目(81102703)-基于AMY1基因拷貝數變異、N-糖基化和β-腎上腺素能受體介導的脾虛證唾液淀粉酶活性改變機制的研究;廣東省科技計劃項目(2013A032500005)-脾-物質代謝關聯”新假說的miRNA物質基礎及“從脾論治“代謝性疾病的分子機制研究”;廣東藥學院科技處-附屬第一 醫 院 聯 合 自 然 科 學 培 育 基 金 項 目 (GYFYLH201303，GYFLH201313)

林 靜(1989-)，女，廣東人，醫學碩士，從事生物化學和分子生物學的研究。

△通訊作者:楊澤民(1979-)，男，湖南人，高級實驗師，醫學博士，從事中西醫結合疾病機制研究，Tel:020-39352192，E-mail:yzm310200@gmail.com。