益氣溫陽法治療免疫性血小板減少癥療效及淋巴細胞免疫調節(jié)研究

全日城，張姍姍，楊曉紅，許勇剛，胡曉梅，劉 鋒，麻 柔

（中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院血液科，北京 100091）

益氣溫陽法治療免疫性血小板減少癥療效及淋巴細胞免疫調節(jié)研究

全日城，張姍姍，楊曉紅，許勇剛，胡曉梅，劉 鋒，麻 柔△

（中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院血液科，北京 100091）

目的：探討益氣溫陽法臨床療效及免疫療效機制。方法：采用美國BECKMAN COULTER公司流式細胞儀三色熒光直接免疫法檢測T、B淋巴細胞亞群，探討CITP病人免疫紊亂狀態(tài)及療效機理。結果：本研究治療組總病例數(shù)28例，完全反應4例（14.29%），有效8例（28.57%），總有效率42.86%。治療前平均Plt計數(shù)（23.02±13.69），治療后平均計數(shù)（46.18±50.47），治療前后血小板計數(shù)差異有統(tǒng)計學意義。機制研究提示，治療后顯著降低NKT細胞、CD3DR＋活化T細胞比值；升高CD19＋CD5＋／CD19＋比值、CD4＋CD25＋Treg細胞和Th2細胞，起到免疫調節(jié)和免疫耐受作用。結論：益氣溫陽法通過降低NKT細胞、CD3DR＋活化T細胞，提高CD4＋CD25＋Treg細胞和Th2細胞，顯著改善免疫紊亂狀態(tài)，改善外周血小板水平。

免疫性血小板減少癥；益氣溫陽法；T、B淋巴細胞亞群；益氣溫陽法

免疫性血小板減少癥（immune thrombocyto?penia，ITP）病程持續(xù)12個月以上者稱為慢性ITP（cITP），cITP具有易反復發(fā)作、治療難度大、治療效果差等特征，由疾病本身和治療相關因素導致的死亡率比正常人群高出4.2倍。cITP常經(jīng)過多種方案治療后血小板仍持續(xù)在安全范圍以下，治療非常棘手?，F(xiàn)代醫(yī)學采用大劑量糖皮質激素、免疫抑制劑、化療藥物、生物制劑（α?干擾素、靜脈丙種球蛋白、rhTPO）、單克隆抗體（利妥昔、阿倫單抗）、血漿置換、免疫吸附等單獨或聯(lián)合措施治療，但文獻報道療效差異很大。這些藥物中多數(shù)治療周期較長，停藥后復發(fā)率高，不良反應明顯。本研究基于麻柔主任醫(yī)師多年治療CITP的經(jīng)驗方，探討益氣溫陽法臨床療效及免疫機制。

1 研究方法

1.1 一般資料

全部病例為2012年6月至2014年10月中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院門診病例，病程在1年以上的CITP病人28例，健康對照組20例。

1.2 診斷標準

診斷標準參照《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2012年版）》［1］。中醫(yī)證候診斷標準參照1987年8月全國中醫(yī)急癥研討會修訂方案，結合2002年《中藥新藥臨床研究指導原則》擬定。脾腎兩虛證辨證參照脾腎陽虛型和氣血虧虛型證候標準。主癥：基本無出血證候，或紫癜色淡紅或暗而稀疏，伴神倦乏力，尤以雙下肢乏力明顯，或畏寒肢冷、腰膝酸軟、喜熱飲、大便溏泄、多尿；次癥：頭暈、心悸、氣短、五更泄瀉，舌淡或淡胖，或舌邊齒痕、苔薄白，脈沉遲或脈弱。具有主癥2項以上或1項主癥加1項以上次癥，再加舌脈象即可診斷。

1.3 納入標準

符合慢性ITP診斷標準，病程＞12個月；相隔1周左右連續(xù)2次的平均血小板計數(shù)＜50×109／L，且不服用激素或潑尼松服用量≤10 mg；符合中醫(yī)脾腎兩虛型辨證分型；年齡在14～75歲之間；未參加其他臨床研究并自愿受試。

1.4 藥物及觀察方法

治療組藥物由太子參、炒白術、茯苓、炙甘草、桂枝、白芍、鎖陽、仙靈脾、川萆薢、巴戟天、補骨脂、生姜、大棗組成，具有健脾益氣、溫腎助陽功效。每日1劑水煎服，早晚分2次服用，每個月根據(jù)患者癥狀適當加減，共觀察4個月。

1.5 觀測指標

1.5.1 外周血象 血小板計數(shù)、白細胞計數(shù)和血紅蛋白含量。

1.5.2 外周血T、B淋巴細胞亞群檢查 采用美國BECKMAN COULTER公司流式細胞儀三色熒光直接免疫法檢測T、B淋巴細胞亞群，主要包括CD3＋CD4＋T、CD3＋CD8＋T、CD4＋／CD8＋比例、CD3?CD16CD56＋NK細胞、NKT細胞、CD3＋CD25＋、CD3＋DR＋活化 T細胞、CD4＋CD25＋Treg細胞、CD19＋B細胞及 CD19＋CD5＋／CD19＋比值，探討CITP病人免疫紊亂狀態(tài)及療效機理。

1.6 療效標準及統(tǒng)計學方法

西醫(yī)療效評判標準參照2012年版《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識》。應用SPSS statistics17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料應用t檢驗，組間差異顯著性先用Levene′s test行方差齊性檢驗，再行獨立樣本或配對樣本t檢驗，根據(jù)方差齊與否選擇檢驗結果。

2 結果

2.1 臨床療效研究

治療組服用益氣溫陽方療程4個月，后期隨訪6個月。治療組總病例數(shù) 28例，完全反應 4例（14.29%），有效 8例 （28.57%），無效 16例（57.14%），總有效率42.86%。治療組中觀察期內使用強的松者共5例，每日劑量均低于10 mg。3例觀察期內由10 mg減至5 mg，其中1例完全反應，1例有效，1例血小板計數(shù)維持不變；1例全程用10 mg／d，血小板維持不變；1例全程5 mg／d，血小板計數(shù)未有變動。

治療組治療前平均 Plt計數(shù)（23.02±13.69）；治療后平均計數(shù)（46.18±50.47），治療前后血小板均數(shù)經(jīng)t檢驗（t值－2.585，P＝0.015），治療前后血小板變化差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。后期觀察6個月，完全反應病例中1例4個月后plt降至80 ×109／L，余病例病情穩(wěn)定。全部病例觀察期間未出現(xiàn)不適不良反應。

2.2 T、B淋巴細胞免疫紊亂研究

本研究治療組可供分析病例25例，健康對照組20例。

表1 治療前后T、B淋巴細胞亞群表達（±s）

表1 治療前后T、B淋巴細胞亞群表達（±s）

注：治療組治療前后比較：?P＜0.05，??P＜0.01；與健康對照組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組 別 時 間 例數(shù) CD3＋CD19? CD3＋CD4＋ CD3＋CD8＋ CD4＋／CD8＋ CD3＋CD25＋ CD3＋DR＋健康組 20 68.37±10.21 39.27±9.18 24.49±7.95 1.83±0.87 4.49±2.29 3.39±1.46治療前 25 77.26±10.14＃ 34.83±8.31 35.38±10.94＃＃ 1.12±0.49＃＃ 6.11±4.56 9.05±6.64＃＃治療后 25 74.05±11.17? 33.63±8.74 33.42±10.09＃＃ 1.11±0.44＃＃ 4.20±2.23 5.10±2.93?＃

表2 治療前后T、B淋巴細胞亞群表達（±s）

表2 治療前后T、B淋巴細胞亞群表達（±s）

注：治療組治療前后比較：?P＜0.05，??P＜0.01；與健康對照組比較：＃P＜0.05；＃＃P＜0.01

組 別 時 間 例數(shù) CD4＋CD25＋／CD4 CD3?CD16＋CD56＋ CD3＋CD16CD56＋ CD3?CD19＋ CD19＋CD5＋／CD19健康組 20 26.34±7.49 13.6±8.22 3.69±1.76 11.53±4.19 23.46± 8.19治療前 25 17.05±6.54＃＃ 8.46±6.85 6.89±5.66＃ 10.69±6.85 16.43±10.94＃治療后 25 26.21±7.08?? 10.30±6.80 3.66±2.48? 11.53±6.87 27.30±14.31??

表1顯示，比較治療組治療前后T、B淋巴細胞亞群變化，并與健康人群為對照。結果治療組與健康對照組比較，治療前CD3＋總T細胞、CTL細胞、CD3＋DR＋活化T細胞、NKT細胞顯著增高，但調節(jié)T細胞（Treg）、CD5＋B淋巴細胞比值顯著降低（P＜0.05），經(jīng)治療后CD3＋總T細胞、NKT細胞比值顯著性下降（P＜0.05）；CD19＋CD5＋／CD19＋比值、CD4＋CD25＋Treg細胞顯著性升高（P＜0.01）；CTL淋巴細胞、CD4＋／CD8＋比值與治療前比較無明顯改善（P＞0.05）；CD3DR＋活化T細胞治療后雖明顯改善，但與健康組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

為進一步驗證這些指標在CITP發(fā)病和緩解中的作用，將治療組分為有效組和無效組進一步探討。

表3顯示，CD4＋CD25＋Treg細胞和 CD19＋CD5＋B細胞顯著性上升，治療前后比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。表4顯示，CTL細胞和CD3＋DR＋活化T細胞治療后未見明顯下降，與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 有效組前后T、B淋巴細胞亞群比較（±s）

表3 有效組前后T、B淋巴細胞亞群比較（±s）

注：有效組治療前后比較：?P＜0.05，??P＜0.01；治療前后與健康對照組比較：＃P＜0.05

組 別 CD3＋CD19? CD3＋CD8＋ CD4＋／CD8＋ NKT CD3＋DR＋ Tregs CD19＋CD5＋／CD19健康組 68.37±10.21 24.49± 7.95 1.83±0.87 3.69±1.76 3.39±1.46 26.34±7.49 23.46± 8.19治療前 74.08±12.96 31.11±10.26 1.30±0.50 7.51±6.80＃ 7.42±5.69＃ 19.84±5.62＃ 15.35± 7.52＃治療后 72.13±14.14 30.22±10.49 1.30±0.37 4.21±2.95 4.34±1.87 27.92±6.47?? 25.56±14.74?

表4 無效組前后T、B淋巴細胞亞群比較（±s）

表4 無效組前后T、B淋巴細胞亞群比較（±s）

注：無效組治療前后比較：?P＜0.05，??P＜0.01；治療前后與健康對照組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組 別 CD3＋CD19? CD3＋CD8＋ CD4＋／CD8＋ NKT CD3＋DR＋ Treg CD19＋CD5＋／CD19健康組 68.37±10.21 24.49± 7.95 1.83±0.87 3.69±1.76 3.39±1.46 26.34±7.49 23.46± 8.19治療前 78.87± 8.10＃＃37.88±11.99＃＃ 1.01±0.53＃＃ 5.80±5.48 9.41±5.95＃＃ 15.11±7.30＃＃ 17.06±12.75治療后 75.38± 8.96? 35.63± 9.58＃＃ 0.97±0.44＃＃ 3.28±2.13 5.61±3.46＃ 25.55±7.66?? 28.50±14.49?

3 討論

麻柔教授根據(jù)其多年臨證經(jīng)驗，治療ITP提出一套辨病辨證結合思路指導臨床，療效顯著。麻柔認為慢性ITP病人主訴癥狀少，臨證關鍵在于抓住主要病機病位，辨證準確，這是臨床取得良效的基礎。并提綱挈領地總結出ITP病機，即在急性期以“火盛”為特點，慢性期以“氣傷”為特點。慢性期所謂氣傷即氣虛，氣虛則氣血生化不足、統(tǒng)攝無權則血溢脈外。即《景岳全書·血證》記載：“損者多由于氣，氣傷則血無以存?！狈沃饕簧碇畾?，又脾腎為先后天之本，后天氣血及元陰元陽由此化生，故麻柔認為CITP“氣傷”具體表現(xiàn)為肺脾氣虛和脾腎兩虛。初期表現(xiàn)以氣虛為主，病情遷延日久，損及陽氣，臨證見四肢不溫、喜熱飲、舌淡胖邊有齒痕、脈沉等陽氣虛損之象。此期紫癜顏色淡紅稀疏或沒有明顯出血點。CITP急性發(fā)作期及反復的病人多表現(xiàn)為虛實夾雜、以虛為本、以火瘀為標等特點，多因外感或過勞誘發(fā)。瘀血既是病理產物也是致病因素，始終貫穿于整個疾病過程。

實際臨證中單純肺脾氣虛型少見，多以脾腎陽虛兼見肺脾氣虛之象，麻柔抓住脾腎陽虛、肺脾氣虛的疾病根本，以益氣溫陽為大法，擬參桂益氣溫陽湯作為治療CITP基本方，加減運用臨證取得良好療效。方中有太子參、炒白術、茯苓、炙甘草、桂枝、白芍、鎖陽、仙靈脾、川萆薢、生姜、大棗。方中參苓白術草取四君子之意健脾益氣、顧氣虛之本；鎖陽、仙靈脾益腎助陽、益火補土。

本研究證明，益氣溫陽方治療CITP臨床療效確切，顯著提升患者PBC，遠期療效穩(wěn)定可靠，可明顯提高患者生活質量，不失為療效明確、安全可靠的CITP治療方案，具有一定社會推廣價值和經(jīng)濟效益。

Liu［2］等證實，CD4＋CD25＋Treg數(shù)量在 ITP活動期及未緩解期比其在正常對照組及緩解期顯著減少。Ahoul?Fotoh［3］等指出，CD4＋CD25＋Treg在ITP活動期顯著減少，而其在ITP完全緩解期則顯著增加。王穎超等［4］研究結果也提示，ITP患兒治療前外周血Th17占CD4＋T細胞比例、Th17／Treg細胞比值均顯著增高，完全反應患兒外周血Th17細胞占CD4＋T細胞比例、Th17／Treg細胞比值顯著低于無效患兒。

治療前后研究提示，參桂益氣溫陽湯通過顯著降低總T細胞、NKT細胞、CD3DR＋活化T細胞比值，升高 CD19＋CD5＋／CD19＋比值、CD4＋CD25＋Treg細胞和Th2細胞，起到免疫調節(jié)和免疫耐受作用，有助于改善外周血小板水平。值得注意的是，治療無效組CTL細胞和CD3＋DR＋活化T細胞的高表達，并不因治療干預而下降，說明益氣溫陽湯不通過CTL細胞和CD3＋DR＋活化T細胞途徑功能起作用，或提示CTL和CD3＋DR＋活化T細胞功能增強可能與ITP治療效果差相關。

Arita等［5］研究顯示，CD5＋B淋巴細胞產生抗體的能力明顯大于CD5?B淋巴細胞，且CD5＋B淋巴細胞計數(shù)與自身抗體數(shù)量成正比，因此CD5＋B淋巴細胞的增多可能增加了自身抗體的產生，從而導致ITP的發(fā)生。黃望香等［6］探討B(tài)淋巴細胞數(shù)量在慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜發(fā)病中的作用。提示CITP初診患者外周血總B淋巴細胞數(shù)及CD5＋CD19＋細胞占CD19＋細胞的百分率治療后顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。我們此次研究顯示，Treg細胞和CD19＋CD5＋B細胞比例隨PLT計數(shù)的上升而升高，且具有統(tǒng)計學意義，與以上文獻結果不一，今后研究中需進一步擴大病例數(shù)予以驗證。

［1］ 中華醫(yī)學會血液學分會血栓與止血學組.成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2012年版）［J］.中華血液學雜志，2012，33（11）：975?977.

［2］ Liu B，Zhao H，Poon MC，et al.Abnormality of CD4＋CD25＋regulatory T cells in idiopathic thrombocytopenic purpura［J］.Eur J Haematol，2007，78（2）：139?143.

［3］ Aboul?Fotoh Lel?M，Abdel Raheem MM，El?Deen MA，et al.Role of CD4＋CD25＋T cells in children with idiopathic thrombocytopenic purpura［J］.J Pediatr Hematol Oncol，2011，33（2）：81?85.

［4］ 王穎超，劉滿菊，朱桂，等.Th17／Treg細胞比例失衡在兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥中的意義［J］.中國當代兒科雜志，2016，18（3）：238?242.

［5］ Arita M，Kodama S，Suzuki M，et al.Single cell analysis of aderoid CD5＋B cells and their protective contributions to nasopharyngeal immunity［J］.Laryngoscope，2003，113：484?491.

［6］ 黃望香，高清平，王海瀾，等.慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜B淋巴細胞數(shù)量及凋亡蛋白表達的研究［J］.右江醫(yī)學，2005，33（3）：217?219.

R558＋.2

：A

：1006?3250（2016）10?1354?03

2016?04?02

全日城（1973?），男（朝鮮族），吉林人，主治醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事中西醫(yī)結合血液病的臨床與研究。

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：麻 柔，主任醫(yī)師，博士研究生導師，Tel：010?62835362。