肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的血漿代謝組學研究*

林 燕，王亞利，張明泉，王鑫國

（1.河北省中醫(yī)院，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學，石家莊 050017；3.河北中醫(yī)學院，石家莊 050090）

肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的血漿代謝組學研究*

林 燕1，王亞利2△，張明泉3，王鑫國3

（1.河北省中醫(yī)院，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學，石家莊 050017；3.河北中醫(yī)學院，石家莊 050090）

目的：運用血漿代謝組學方法研究肺衛(wèi)氣虛證患者的血漿代謝組學特征，以探索伴隨肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的潛在標記物。方法：春、夏、秋、冬4個季節(jié)分別選擇反復上呼吸道感染肺衛(wèi)氣虛證患者，設為疾病組給予玉屏風顆粒干預，60 d為1個療程。同時每個季節(jié)設對應健康組，并分別對健康組及疾病組治療前后采集血液；采用高效液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測3組的血漿代謝物，利用主成分分析、偏最小二乘法對檢測到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：四季推測出不完全相同的肺衛(wèi)氣虛證的潛在標志物；推測并反證了半胱氨酸、L?蛋氨酸是伴隨肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的潛在標記物。結(jié)論：四季發(fā)現(xiàn)不完全相同的潛在標志物與肺衛(wèi)之氣的節(jié)律性相關，推測半胱氨酸、L?蛋氨酸是伴隨肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的潛在標記物。

肺衛(wèi)之氣；年節(jié)律；代謝組學；血漿；潛在標志物

中醫(yī)學天人相應理論認為，人與自然界是統(tǒng)一的，肺衛(wèi)之氣的運行也受四時陰陽的影響呈現(xiàn)一定的節(jié)律變化。本研究擬借助代謝組學技術，通過研究反復上呼吸道感染肺衛(wèi)氣虛證患者及玉屏風顆粒干預的血漿代謝組學特征，探索伴隨肺衛(wèi)之氣年節(jié)律出現(xiàn)的潛在標記物。

1 臨床資料

1.1 診斷標準與分型標準

1.1.1 反復上呼吸道感染的診斷標準 病程在1年以上，反復出現(xiàn)上感癥狀，間隙時間一般不少于7 d，每年上感≥5次［1］。

1.1.2 肺衛(wèi)氣虛證診斷標準 參照中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《中藥新藥臨床指導原則》［2］及相關文獻［3］制定。主癥：易患外感性疾病、畏風寒、自汗、舌淡苔白、脈浮弱；次癥：反復咳嗽或咳喘、流涕、咽痛、乏力、不耐寒熱。具備主癥2項、次癥2項或主癥1項、次癥3項以上即可診斷。

1.2 納入和排除標準

納入標準：符合上述反復上呼吸道感染，中醫(yī)辨證符合肺衛(wèi)氣虛證的診斷標準；年齡在18～60歲，經(jīng)檢查血、尿常規(guī)、肝、腎功能、血糖及血脂正常，心電圖無明顯異常；同意且配合治療者。排除標準：原發(fā)性免疫缺陷病患者；先天性呼吸道畸形患者；合并心、肝、腎和造血系統(tǒng)嚴重原發(fā)性疾病者，妊娠或哺乳期婦女；不符合納入標準、未滿規(guī)定觀察期中斷治療者。

1.3 病例來源

分別在2012年8月7日（立秋）至2012年11月6日、2012年11月7日（立冬）至2013年2月3日、2013年2月4日（立春）至2013年5月4日、2013年5月5日（立夏）至2013年8月6日選出符合診斷條件的患者15例、30例、23例、17例設為疾病組；同時每個季節(jié)對應設健康組18例、31例、26例、10例。4個季節(jié)2組的性別、年齡分布等基線情況比較差異無統(tǒng)計學意義。

2 方法

2.1 治療方法

疾病組給予玉屏風顆粒（主成分：黃芪、白術、防風，廣州環(huán)球制藥有限公司，每盒15袋），每次1袋，每日3次口服；并根據(jù)癥狀給予止咳等對癥處理，囑多休息、清淡飲食、多飲水等，60 d為1個療程。健康組不予干涉正常生活。

2.2 檢測方法與標本制備［4?6］

健康組、疾病組治療前后分別空腹抽取靜脈血2 ml（EDTA抗凝），血樣常溫靜置2 h，3000 r／min離心10 min，取血漿0.5 mL置于凍存管中液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

檢測前將血漿樣本放置4℃解凍復溶，乙腈、蒸餾水4℃過夜預冷。乙腈與血漿樣本3∶1混合渦旋，離心機14000 r／m、10 min沉淀蛋白后，與乙腈、蒸餾水按照2∶2∶6稀釋，渦旋移入液相小瓶備用。

質(zhì)量控制樣本（quality control，QC）制備方法：所有健康組樣本室溫解凍復融、渦旋振蕩，分別吸取10 μL血清，再次渦旋振蕩充分混勻后分裝于EP管中，每管為100 μL，即為QC，其余處理同樣本處理方法。

利用紅外線成像儀測試，土墻日光溫室散熱有熱橋存在[2]，主要是導熱體的砼圈梁前坎，其次是后坡與前棚之間、后坡與側(cè)墻之間的縫隙，造成溫室密閉性不夠，導致氣體存在貫流散熱。三是后坡結(jié)構(gòu)簡單，厚度不足，隔熱保溫能力差，四是散熱面最大的為前棚面上的保溫被，其質(zhì)量好壞直接影響著溫室的溫度。彩鋼后屋面主要是彩鋼和墻體的縫隙，使用后，形成的彩鋼板之間的縫隙，造成大量散熱，以及聚苯板容重小，厚度不足，隔熱性能達不到要求。

2.3 儀器設備與試劑

高效液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC?MS）、色譜柱、乙腈、甲醇、蒸餾水等。

圖1 春季疾病組和健康組的PCA圖（黑方塊代表疾病組，黑三角代表健康組，下同）

2.4 代謝數(shù)據(jù)處理［5］

經(jīng)HPLC?MS得到代謝譜數(shù)據(jù)，采用SIMCA?P軟件處理得到指紋圖譜。處理過程采用數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換、導入；圖譜查看、對比（總離子流圖、二維圖像、三維圖像、質(zhì)譜圖像）；去噪音；質(zhì)譜峰提取；反卷積處理；峰排列、對齊、合并；峰合并后開始列表去噪音；縫隙填補處理等。數(shù)據(jù)處理采用多種方式，包括主成分分析（principle component analysis，PCA）、偏最小二乘法分析（partial least squares，PLS）。

3 結(jié)果

3.1 四季PCA圖及潛在標志物

3.1.1 春季 ①疾病組與健康組PCA圖。圖1顯示，PCA可以從總體上反映各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。判別模型質(zhì)量好壞的主要參數(shù)為R2X，它代表模型的解釋率，一般來說其值大于0.4即表示該模型可靠［4?6］。本分析在正離子模式下共獲得6個主成分，累積R2X＝0.471，因此當前PCA模型適合解釋2組之間的代謝差異。疾病組和健康組處在不同的區(qū)域，表明2組的代謝成分不同（代謝物成分相似的樣本集中在相近的區(qū)域），疾病組的代謝出現(xiàn)紊亂。②疾病組治療后與健康組的PCA圖。圖2顯示，本分析在正離子模式下共獲得4個主成分，累積R2X＝0.448。2組之間分離并不完全，表明疾病組在治療后向健康組回歸，其紊亂的代謝得以回調(diào)，兩者的代謝成分相似；③潛在標志物。根據(jù)2組的PLS分析，對分組貢獻較大的重要變量因子（VIP）值進行提取，經(jīng)t檢驗篩選出差異變量，根據(jù)變量的質(zhì)荷比、保留時間等，利用人類代謝組學數(shù)據(jù)庫HMDB（www.hmdb.ca／metabolites）進行檢索［5?6］。結(jié)果初步比對并推測出L?蛋氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、焦谷氨酸等9種物質(zhì)為肺衛(wèi)氣虛證的潛在標志物（VIP＞1為差異有統(tǒng)計學意義；根據(jù)t值，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義）。

圖2 春季疾病組治療后與健康組的PCA圖（黑點代表疾病組治療后，黑三角代表健康組，下同）

3.1.2 夏季 ①疾病組與健康組PCA圖。圖3顯示，在正離子模式下共獲得7個主成分，累積R2X＝0.421，2組分別處于不同的區(qū)域，可以被明顯分類；②疾病組治療后與健康組 PCA圖。圖4顯示，正離子模式下共獲得7個主成分，累積R2X＝0.407。2組處于相近的區(qū)域，部分融合交織，不能明顯區(qū)分開，表明疾病組治療后紊亂的代謝得以回調(diào)，向健康組回歸；③潛在標志物。初步比對并推測出半胱氨酸、L?蛋氨酸、焦谷氨酸等7種物質(zhì)為肺衛(wèi)氣虛證的潛在標志物。

表1 春季潛在標志物

圖3 夏季疾病組與健康組PCA圖

圖4 夏季疾病組治療后與健康組PCA圖

表2 夏季潛在標志物

圖5 秋季疾病組與健康組PCA圖

圖6 秋季疾病組治療后與健康組PCA圖

表3 秋季潛在標志物

3.1.3 秋季 ①疾病組與健康組PCA圖。圖5顯示，本分析在正離子模式下共獲得6個主成分，累積R2X＝0.813，適合解釋2組之間的代謝差異；②疾病組治療后和健康組的PCA圖。圖6顯示，正離子模式下共獲得4個主成分，累積R2X＝0.697；③潛在標志物。初步比對并推測出L?蛋氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、焦谷氨酸等6種物質(zhì)為肺衛(wèi)氣虛證的潛在標志物。

3.1.4 冬季 ①疾病組與健康組PCA圖。圖7顯示，正離子模式下共獲得6個主成分，累積R2X＝0.499；②疾病組治療后與健康組PCA圖。圖8顯示，正離子模式下共獲得5個主成分，累積R2X＝0.477；③潛在標志物。推測出 L?蛋氨酸、半胱氨酸、焦谷氨酸、L?天冬氨酸等6種物質(zhì)為肺衛(wèi)氣虛證的潛在標志物。

圖7 冬季疾病組與健康組PCA圖

圖8 冬季疾病組治療后與健康組PCA圖

表4 冬季潛在標志物

3.2 伴隨肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的潛在標志物

四季出現(xiàn)不完全相同的潛在標志物，其中半胱氨酸、L?蛋氨酸、蘇氨酸、焦谷氨酸伴隨肺衛(wèi)氣虛證全年，進一步標記這4種物質(zhì)在4個季節(jié)疾病組／健康組的倍性變化值［6］，可以發(fā)現(xiàn)半胱氨酸、L?蛋氨酸呈現(xiàn)春夏較高、秋冬較低的趨勢，符合肺衛(wèi)之氣春夏強、秋冬弱的節(jié)律，推測這2種物質(zhì)是伴隨肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的潛在標記物。

3.3 潛在標志物的反證［6］

倍性變化是一種描述2個相比對象數(shù)量差異的方法。通過比對潛在標志物在疾病組／健康組和治療后／健康組的倍性變化值，即可說明該物質(zhì)在治療前后的變化。對比并發(fā)現(xiàn)半胱氨酸和L?蛋氨酸治療前后的倍性變化值呈上升趨勢，近乎健康水平。說明隨著患者疾病的恢復，半胱氨酸、L?蛋氨酸也相應地向健康組回調(diào)，從治療角度反證了它們作為潛在證候標志物的可靠性。

表5 潛在標志物四季疾病組、健康組的倍性變化值

表6 半胱氨酸、L?蛋氨酸治療前后倍性變化值比較

4 討論

四季氣候的變化對人體產(chǎn)生影響，人體陽氣的屏障作用對氣候因素尤其敏感［7］。本課題組曾做了大量相關研究［8?9］，表明肺衛(wèi)之氣存在春夏強、秋冬弱的趨勢。

本研究的采樣時間嚴格按照“四立”的時間點來確定季節(jié)的起止，結(jié)果顯示在四季發(fā)現(xiàn)了不完全相同的潛在標志物，推測是因為季節(jié)的變化刺激機體后，機體進行相應調(diào)節(jié)，體內(nèi)的代謝模式或通路也隨之發(fā)生改變，使代謝產(chǎn)物產(chǎn)生變化所致。該結(jié)果與肺衛(wèi)之氣的節(jié)律性相關。

半胱氨酸有強化機體防衛(wèi)、防御的能力。谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸等組成，其活性基團是半胱氨酸殘基上的巰基。Tunon［10］等研究顯示，谷胱甘肽有明顯晝夜節(jié)律；Smaaland［11］等的測定表明，健康成人骨髓內(nèi)谷胱甘肽的含量存在晝夜變化。以上研究表明，谷胱甘肽存在明顯的生物節(jié)律，作為谷胱甘肽的重要組成成分和活性基團提供者的半胱氨酸，其生物節(jié)律可以通過谷胱甘肽表現(xiàn)。

研究發(fā)現(xiàn)［12］，L?蛋氨酸有增加免疫的作用，它還是體內(nèi)最重要的甲基供體，褪黑素的合成即需其提供甲基，褪黑素的節(jié)律性已有相關報道［13］。蛋氨酸在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成半胱氨酸和谷胱甘肽，因此蛋氨酸的節(jié)律性可以通過褪黑素及谷胱甘肽表達。

雖然目前尚無半胱氨酸和L?蛋氨酸存在年節(jié)律的臨床與動物實驗報道，但它們具有增強免疫和春夏強、秋冬弱的特性，與肺衛(wèi)之氣具有衛(wèi)外和節(jié)律性的特性相符合，因此推測它們是伴隨肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的潛在標志物。

本研究首次從系統(tǒng)生物學角度推測并反證了半胱氨酸和L?蛋氨酸是伴隨肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的潛在標志物，揭示了肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的內(nèi)源性物質(zhì)基礎和調(diào)控機制。但該研究尚在探索階段，存在一定的不足。下一步課題組將進行人體其他代謝物（如尿液、唾液等）等研究，以期全方位、多層次地闡明肺衛(wèi)之氣年節(jié)律的本質(zhì)。

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Plasma Metabolism of the Lung Wei Qi in the Rhythm of the Year

LIN Yan1，WANG Ya?li2△，ZHANG Ming?quan3，WANG Xin?guo3
（1.TCM Hospital of Hebei Province，Hebei，Shijiazhuang 050011，China；2.Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；3.TCM College of Hebei，Shijiangzhuang 050090，China）

Objective：By studying the plasma metabonomics characteristics of patients with Fei?Wei?qi deficiency syndrome（FWDQS），thus to explore the potential biomarkers along with the year biorhythm of qi of Fei?Wei.Methods：The patients with recurrent upper respiratory infection with FWQDS were recruited as sick groups respectively in spring，summer，autumn，and winter.Yupingfeng Granule（YPFG）were given as intervention，60 days is one therapeutic course.The control groups were set correspondently in four seasons.The blood was collected respectively on patients in control groups and sick groups before and after treatment.The plasma metabolites were detected using high performance liquid chromatography?mass spectrometry，statistical data were analyzed by principal component analysis and partial least squares.Results：The potential biomarkers of FWQDS were not completely the same in four seasons.L?Cysteine and L?Methionine were inferred and disproved as the possibly potential biomarkers along with the year biorhythm of qi of Fei?Wei.Conclusions：There were not exactly the same potential biomarkers in four seasons.This result is associated with the biorhythm of qi of Fei?Wei.L?Cysteine and L?Methionine were the potential biomarker along with the year biorhythm of it.

Qi of Fei?Wei；Year Biorhythm；Metabonomics；Plasma；Metabolic Biomarkers.

R256.1

：A

：1006?3250（2016）10?1336?04

2016?03?18

國家自然科學基金資助項目（81273609）?基于代謝組學的衛(wèi)氣節(jié)律機制及方藥干預研究

林 燕（1972?），女，河北石家莊人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事中西醫(yī)結(jié)合兒科呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病及疑難雜癥的臨床與研究。

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：王亞利，Tel：0311?86261276，E?mail：Wang1955＠163.com。