健脾消癌方對(duì)大腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝組織MMP?9、TIMP?1表達(dá)的影響*

楊 曉，蔣益蘭，李勇敏，譚小寧，簡(jiǎn)小蘭，羅 星

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006）

健脾消癌方對(duì)大腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝組織MMP?9、TIMP?1表達(dá)的影響*

楊 曉1，蔣益蘭2△，李勇敏2，譚小寧2，簡(jiǎn)小蘭1，羅 星2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006）

目的：研究中藥健脾消癌方對(duì)大腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝組織中基質(zhì)金屬蛋白酶?9（MMP?9）及組織金屬蛋白酶抑制劑?1（TIMP?1）表達(dá)的影響，探索其防治大腸癌肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。方法：建立人大腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型，將模型按隨機(jī)數(shù)字表法分為健脾消癌方組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、空白對(duì)照組并觀察各組裸鼠肝轉(zhuǎn)移情況，測(cè)定其肝組織中MMP?9、TIMP?1表達(dá)量。結(jié)果：健脾消癌方組肝轉(zhuǎn)移率低于模型組及陽(yáng)性對(duì)照組；健脾消癌方組肝組織中MMP?9及TIMP?1表達(dá)低于陽(yáng)性對(duì)照組及模型組，高于空白對(duì)照組；健脾消癌方組MMP?9／TIMP?1比值低于陽(yáng)性對(duì)照組及模型組，而與空白對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：健脾消癌方可抗結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP?9及TIMP?1表達(dá)、保持二者間的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。

健脾消癌方；大腸癌；肝轉(zhuǎn)移；MMP、TIMP表達(dá)

大腸癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者預(yù)后差的主要原因。前期研究證實(shí)，健脾消癌方能降低大腸癌術(shù)后患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，并可降低大腸癌術(shù)后裸鼠模型肝轉(zhuǎn)移率。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解及血管生成情況，在一定程度上影響結(jié)直腸癌患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。其中MMP?9能特異性地破壞基底膜的明膠纖維，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移尤其受到重視［1］。而TIMPs是MMPs的天然抑制物，其中TIMP?1能抑制絕大多數(shù)MMPs活性［2］。因此，本實(shí)驗(yàn)擬從MMP?9及TIMP?1入手，探索健脾消癌方抗大腸癌肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

BALB／c?nu裸鼠48只，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量16～20 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號(hào)43004700001492），于 SPF環(huán)境中飼養(yǎng)。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)買于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 主要試劑及儀器

小鼠MMP?9、TIMP?1試劑盒，上海國(guó)藥生物有限公司；倒置顯微鏡，德國(guó)LEICA公司；CO2恒溫孵育箱，法國(guó)Jouan6500系列；電泳儀，Bio?rad公司；手術(shù)相關(guān)器械由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 藥物及制備

健脾消癌方由黨參、白術(shù)、茯苓、法夏、黃芪、靈芝、炒枳殼、薏苡仁、仙靈脾、郁金、莪術(shù)、白花蛇舌草、半枝蓮、重樓、甘草組成。以上藥物依照《中華人民共和國(guó)藥典》（2012年版）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格采購(gòu)于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房。取以上15味藥，5倍量處方，10倍溫水浸泡0.5 h，加熱煎2 h趁熱過(guò)濾。藥渣再加8倍水煎煮2次，每次0.5 h趁熱過(guò)濾。將3次水煎溶液混勻、過(guò)濾，減壓濃縮至濃度為2.1 g／ml的溶液，0.25 g／支，密封后4℃保存?zhèn)溆谩ｊ?yáng)性對(duì)照藥5?氟尿嘧啶購(gòu)自北京紫竹藥業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿80% ～90%時(shí)予以傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至約合80個(gè)T25瓶量時(shí)（每瓶長(zhǎng)滿約2×106個(gè)細(xì)胞），于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用胰酶消化后收集細(xì)胞，并以2000 r／min離心5 min后，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度約4× 107／ml，收集好的細(xì)胞盡快接種。

2.2 模型制備

隨機(jī)選出 38只裸鼠造模，于無(wú)菌環(huán)境下用2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠（40 mg／kg）后，在左下腹切開(kāi)約2.5 cm切口，使盲腸完全暴露于腹腔外。用100 ul微量注射器吸取50 ul HCT116細(xì)胞后，與盲腸壁呈30°角傾斜進(jìn)針，進(jìn)針深度約5 mm，將細(xì)胞注入盲腸漿膜和肌層之間，注射后用棉簽在距離注射點(diǎn)2mm處輕壓并迅速退針。確保無(wú)細(xì)胞懸液外滲后，用3%碘酒清潔注射區(qū)域以免種植轉(zhuǎn)移，將盲腸回納腹腔，以3?0絲線間斷縫合腹壁。

2.3 分組給藥

接種細(xì)胞15 d后，造模裸鼠存活32只，隨機(jī)選擇2只處死后解剖腹腔觀察肝臟表面，均有白灰色轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成。其余30只按隨機(jī)數(shù)字表法分為健脾消癌方組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組及模型組，10只未接種細(xì)胞的裸鼠作為空白對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。造模后第15天開(kāi)始給藥。健脾消癌方按70 kg成人320 g／d用量計(jì)算，20 g裸鼠每日劑量為320× 0.0026／0.02＝41.6 g／kg，中藥溶液灌胃量按2 ml／100 g計(jì)算，每日1次；陽(yáng)性對(duì)照組裸鼠腹腔注射濃度為13 mg／ml的5?Fu（生理鹽水配制），每次給藥10 ml／kg，隔3 d給藥1次；模型組及空白對(duì)照組以生理鹽水灌胃2 ml／100 g，每日1次。連續(xù)給藥4周，末次給藥2 h后處死。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 肉眼觀察 動(dòng)物死亡或處死后即刻打開(kāi)腹腔，充分暴露肝臟，仔細(xì)觀察肝臟表面有無(wú)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，同時(shí)觀察腹腔淋巴結(jié)及其他臟器有無(wú)轉(zhuǎn)移。

2.4.2 形態(tài)學(xué)觀察 裸鼠死亡后，取裸鼠部分肝臟標(biāo)本（有轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)者以結(jié)節(jié)為中心取材）以10%福爾馬林固定，24 h后以蘇木精?伊紅（HE）染色制作病理切片，置于顯微鏡下觀察。

2.4.3 肝組織MMP?9、TIMP?1蛋白表達(dá)檢測(cè)

稱取0.1 g肝組織，用PBS洗滌1次后加入200 ulRIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)過(guò)電泳及轉(zhuǎn)膜后加入100 ml／L 5%的脫脂奶粉，封閉60 min，加入MMP?9、TIMP一抗（稀釋比例1∶200），4℃過(guò)夜，TBS?T洗3次后將稀釋后的二抗（用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例1∶3000）與膜共同孵育45～60 min。TBS?T洗3次后，采用化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，掃描底片。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較符合正態(tài)分布，方差齊性采用LSD法，符合正態(tài)分布、方差不齊采用Tamhane′s T2法，不符合正態(tài)性用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 健脾消癌方對(duì)肝轉(zhuǎn)移的影響

圖1顯示，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及健脾消癌方組可在裸鼠肝臟表面見(jiàn)1個(gè)或多個(gè)白灰色轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，部分裸鼠可見(jiàn)肺及腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

圖2顯示，光鏡下觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組肝臟細(xì)胞生長(zhǎng)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整。健脾消癌方組、陽(yáng)性對(duì)照組以及模型組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞。部分裸鼠肝臟可見(jiàn)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的癌細(xì)胞團(tuán)，切片染色示分化差的腺癌，部分裸鼠肝臟鏡下可見(jiàn)壞死組織帶。健脾消癌方組中5例未見(jiàn)肝轉(zhuǎn)移瘤，其中1例可見(jiàn)異常增生的肝細(xì)胞，深染，未見(jiàn)細(xì)胞漿，肝細(xì)胞呈核分裂狀態(tài)。

3.2 健脾消癌方對(duì)肝組織MMP?9、TIMP?1表達(dá)的影響

表1顯示，與空白對(duì)照組比較，各組MMP?9及TIMP?1表達(dá)均增加（P＜0.05）；健脾消癌方組MMP?9及TIMP?1表達(dá)低于陽(yáng)性對(duì)照組及模型組（P＜0.05）。提示結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝組織中MMP?9及TIMP?1表達(dá)升高，健脾消癌方能降低大腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝組織中MMP?9及TIMP?1蛋白表達(dá)水平。此外，模型組及陽(yáng)性對(duì)照組MMP?9／TIMP?1比值較空白對(duì)照組明顯增加（P＜0.01）；而健脾消癌方組與空白對(duì)照組比較，MMP?9／TIMP?1比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；健脾消癌方組MMP?9／TIMP?1比值低于陽(yáng)性對(duì)照組及模型組（P＜0.01）。提示結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝組織中MMP?9／TIMP?1有升高趨勢(shì)，健脾消癌方能降低大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝組織中MMP?9／TIMP?1比值。

圖1 造模各組裸鼠肝轉(zhuǎn)移情況肉眼觀察

圖2 各組裸鼠肝臟病理切片鏡下觀察

表1 各組裸鼠肝轉(zhuǎn)移率及肝組織中MMP?9、TIMP?1蛋白表達(dá)比較

4 討論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是大腸癌患者死亡的主要原因。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中必須克服的生理屏障。大量研究證實(shí)，MMPs是降解ECM最重要的酶類。Derek C.Marshall［3］等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MMP?9的選擇性抑制劑可減慢外科原位移植結(jié)直腸癌模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度，并降低轉(zhuǎn)移發(fā)生率，表明MMP?9可促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。TIMPs作為MMPs的天然抑制物可下調(diào)MMPs活性，對(duì)于維持ECM的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。TIMP?1可通過(guò)與MMPs或其前體結(jié)合而抑制大多數(shù)MMPs活性。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝組織中 MMP?9及TIMP?1均有升高趨勢(shì)，中藥復(fù)方在抗大腸癌肝轉(zhuǎn)移的同時(shí)，二者表達(dá)水平均降低。

陶國(guó)全［4］研究發(fā)現(xiàn)，TIMP?1蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)增高，此結(jié)果與本研究一致。并發(fā)現(xiàn)TIMP?1表達(dá)高低與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)，下調(diào)TIMP?1基因表達(dá)能顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力，提示TIMP?1除可通過(guò)MMPs途徑抑制ECM降解外，還可能通過(guò)其他途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。維持TIMP?1與其他相關(guān)分子間的動(dòng)態(tài)平衡，可能是改善大腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。

健脾消癌方是蔣益蘭教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)以“健脾益氣，化瘀解毒”為法創(chuàng)制而成。前期研究表明［5］，該方能在一定程度上降低大腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，延長(zhǎng)患者生存期。本研究結(jié)果表明，健脾消癌方可下調(diào)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝組織中MMP?9、TIMP?1表達(dá)，恢復(fù)MMP?9／TIMP?1比值，提示健脾消癌方可能通過(guò)下調(diào)MMP?9及TIMP?1表達(dá)，保持二者間的動(dòng)態(tài)平衡，發(fā)揮抗結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移作用，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

［1］ 劉超，仰曙芬，付玉.MMP2、MMP9與結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展［J］.中華結(jié)直腸疾病電子雜志，2014，3（3）：195?197.

［2］ Visse R，HideakiN.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases structure， function， and biochemistry［J］.Circ Res，2003，92：827.

［3］ Derek C.Marshall1，Susan K.Lyman1，Scott McCauley，etal.Selective Allosteric Inhibition of MMP9 Is Efficacious in Preclinical Models of Ulcerative Colitis and Colorectal Cancer［J］.PLOS One，2015，10（5）：e0127063.

［4］ 陶國(guó)全.TIMP1在結(jié)直腸癌中的作用及其調(diào)控機(jī)制［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

［5］ 蔣益蘭，俞天俊，趙曄.健脾消癌方治療老年中晚期大腸癌臨床觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（3）：94?96.

Effect of Jianpi Xiaoai Prescription on MMP?9 and TIMP?1 Expression in the Liver Tissue on Nude Mice Model of Colorectal Cancer with Liver Metastasis

YANG Xiao1，JIANG Yi?lan2△，LI Yong?min2，TAN Xiao?ning2，JIAN Xiao?lan1，LUO Xing2
（1.Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.The Hospital Attached to Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410006）

Objective：To investigate the effects of Jianpi Xiaoai Recipe on Matrix metalloproteinases?9（MMP?9）and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase?1（TIMP?1）expression in liver tissues of nude mice model of liver metastasis of colon cancer.Methods：The HCT116 cells were used to establish the model of colon cancer liver metastasis in nude mice.Then the models were randomly divided into Jianpi Xiaoai Recipe group，positive control group，model group and blank control group.The expression of MMP?9 and TIMP?1 in liver tissues was tested by Western Blot method.Results：The liver metastasis rate and the expression of MMP?9 and TIMP?1 in the liver tissues were significantly lower in Jianpi Xiaoai Recipe group than in the model group and the positive control group；The MMP?9／TIMP?1 ratio was lower in Jianpi Xiaoai Fang group than in the model group and the positive control group，but there was no significant difference between Jianpi Xiaoai Recipe group and the blank control group.Conclusion：Jianpi Xiaoai Recipe could reduce the liver metastasis rate of colon cancer，the mechanism may down regulats the expression of MMP?9 and TIMP?1 in liver tissues，and maintain the dynamic balance between them.

Jianpi Xiaoai Recipe；Colorectal cancer；Liver metastasis；The expression of MMP?9 and TIMP?1

R285.5

：B

：1006?3250（2016）10?1323?03

2016?04?06

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81373602）?結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移狀態(tài)與TGF?β調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)性及益氣化瘀解毒方干預(yù)作用研究；湖南省科技計(jì)劃科研條件創(chuàng)新專項(xiàng)（2013TT1004）?SW620型裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型及血管生成因子調(diào)控的研究

楊 曉（1989?），女，河南商丘人，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治方法與規(guī)律研究。

△

：蔣益蘭（1961?），女，湖南邵陽(yáng)人，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，湖南省名中醫(yī)，從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治方法與規(guī)律研究，Tel：15574977175，E?mail：tianshangren624＠163.com。