盾葉薯蕷中薯蕷總皂苷生物酶預(yù)處理法提取工藝研究

楊光義，雷 攀，2，杜士明，2，惠小娜，葉 方，張晨寧，魏晉寶

（1．湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000； 2．湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065）

盾葉薯蕷中薯蕷總皂苷生物酶預(yù)處理法提取工藝研究

楊光義1，雷 攀1，2，杜士明1，2，惠小娜1，葉 方1，張晨寧1，魏晉寶1

（1．湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000； 2．湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065）

目的 建立高效提取盾葉薯蕷中薯蕷總皂苷的新方法。方法 以薯蕷總皂苷的得率為指標(biāo)，采用單因素試驗對生物酶預(yù)處理過程的酶解溫度、pH、生物酶預(yù)處理水用量、酶用量、酶解時間5個因素進(jìn)行考察，以正交試驗設(shè)計對醇提總皂苷過程的乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)4個因素進(jìn)行考察。結(jié)果 生物酶預(yù)處理過程最佳酶解條件：酶解溫度70℃，pH＝5．5，生物酶預(yù)處理水用量4 L／kg，酶用量8 mL／kg，酶解時間24 h；醇提總皂苷過程最佳提取條件：60%乙醇為溶劑，料液比1∶8，提取2次，每次1．0 h。結(jié)論 新工藝可穩(wěn)定高效地提取出盾葉薯蕷中的薯蕷總皂苷。

盾葉薯蕷；生物酶預(yù)處理；薯蕷總皂苷；提取工藝

盾葉薯蕷 Dioscorea Zingiberensis C．H．Wright別名黃姜、火頭根，為薯蕷科薯蕷屬多年生纏繞草質(zhì)藤本植物，廣泛分布于我國的湖北、陜西、河南、湖南等地，其中湖北和陜西種植面積較大，約占全國的70%[1－2]。薯蕷皂苷（dioscin）是盾葉薯蕷根莖中的主要活性成分，具有脫敏、祛痰、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、調(diào)血脂、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[3－8]。此外，薯蕷皂苷脫去糖苷鍵生成的薯蕷皂苷元是合成甾體激素類藥物和口服避孕藥的重要原料，世界上約有2／3的甾體激素類藥物都是以此為原料合成的[9]。

目前，工業(yè)生產(chǎn)薯蕷皂苷主要是以水或醇溶液為溶劑，直接進(jìn)行回流提取。該法操作簡單，但薯蕷皂苷得率低，主要原因是淀粉和纖維素占盾葉薯蕷干重的82．5%，大部分薯蕷皂苷被緊密包裹在淀粉和纖維素中[10]，不易被提取出來。本課題組擬以生物酶除去淀粉和纖維素后，再以適宜的溶劑進(jìn)行提取，從而提高薯蕷總皂苷得率。本試驗分別對生物酶預(yù)處理條件和總皂苷的提取條件進(jìn)行了考察，確定了生物酶預(yù)處理法提取盾葉薯蕷中薯蕷總皂苷的最佳工藝參數(shù)。

1 儀器與材料

1．1 儀器

TU－1901型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AUW－120D型電子分析天平（日本島津）；RE－2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TDL－5A型離心機(jī)（德國菲恰爾公司）；VORTEX－5型漩渦混合器；pHS－25型數(shù)顯pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SKFO－0型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱。

1．2 材料

盾葉薯蕷由湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司提供，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室主任陳吉炎教授鑒定為薯蕷科植物盾葉薯蕷 Dioscorea zingiberensis C．H．Wright的根莖，粉碎，過4號篩，備用；薯蕷皂苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號為111707－201402）；纖維素酶（Celluclast）、淀粉酶（BAN 480L）均購自諾維信中國生物技術(shù)有限公司；甲醇為色譜純，乙醇、高氯酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2．1 薯蕷總皂苷含量測定方法[11]

2．1．1 溶液制備

精密稱取薯蕷皂苷對照品5．03 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，得質(zhì)量濃度為0．503 0 g／L對照品溶液。

取盾葉薯蕷粉末5 g，加適量水混勻，自然pH條件下，加復(fù)合生物酶（淀粉酶與纖維素酶1∶1比例混合）適量，混勻，在一定溫度條件下酶解24 h，3 000 r／min離心5 min，棄上清液，沉淀80℃烘干，研碎，得盾葉薯蕷酶解物。酶解物置100 mL圓底燒瓶中，加適量乙醇溶液，水浴回流提取1 h，離心，取上清液，沉淀再重復(fù)提取1次，合并2次上清液，置100 mL容量瓶中，加相應(yīng)濃度乙醇溶液定容至刻度，搖勻，即得樣品溶液。

精密量取樣品溶液2 mL，置10 mL容量瓶中，加相應(yīng)提取溶劑定容至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．1．2 方法學(xué)考察

測定波長選擇：精密量取薯蕷皂苷對照品溶液0．2mL進(jìn)行顯色。置10 mL具塞試管中，揮干溶劑后，精密加入高氯酸 5 mL，70℃水浴15 min，冰水浴中冷卻至室溫。以高氯酸為參比，在200～500 nm波長下用紫外分光光度計掃描，確定最大吸收波長，結(jié)果在406 nm波長處有最大吸收。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取薯蕷皂苷對照品溶液0．05，0．10，0．20，0．30，0．40，0．50，0．60 mL，經(jīng)高氯酸顯色后于406 nm波長測定吸光度并記錄。以薯蕷皂苷含量(X)為橫坐標(biāo)、吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 Y＝3．443 3 X－0．043，R2＝0．999 2 (n＝7)。結(jié)果表明，在上述條件下，薯蕷皂苷質(zhì)量濃度在0．050 3～0．301 8 g／L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗：精密量取0．503 0 g／L薯蕷皂苷對照品溶液6份，每份0．1 mL，分別按顯色方法進(jìn)行顯色，于406 nm波長處測定吸光度。結(jié)果吸光度的 RSD為1．16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：分別于供試品溶液制備0，1，2，4，8 h時按顯色方法進(jìn)行顯色，406 nm波長處測定吸光度。結(jié)果的 RSD為1．09%（n＝6），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品溶液6份，依法制備供試品溶液，并按顯色方法進(jìn)行顯色，于406 nm波長處測定吸光度。結(jié)果的 RSD為2．03%（n＝6），表明該方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗：取已知含量的供試品溶液6份，每份0．1 mL，分為3組，分別精密加入0．503 0 g／L薯蕷皂苷對照品溶液0．1 mL，按顯色方法進(jìn)行顯色，于406 nm波長處測定吸光度，計算回收率。結(jié)果平均回收率為99．04%，RSD為2．19%(n＝6)。

2．1．3 樣品含量測定

精密量取樣品溶液2 mL及對照品溶液，經(jīng)高氯酸顯色，測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算薯蕷總皂苷含量。

2．2 工藝考察

2．2．1 單因素試驗優(yōu)化生物酶預(yù)處理盾葉薯蕷工藝

[12]，生物酶預(yù)處理過程中，溫度、pH、生物酶預(yù)處理水用量、酶用量、酶解時間是影響預(yù)處理效果的主要因素。本試驗以薯蕷總皂苷得率為指標(biāo)，采用單因素試驗對上述因素進(jìn)行考察，優(yōu)選出最佳酶預(yù)處理條件。

酶解溫度：取盾葉薯蕷粉末6份，每份5 g，加一定量的水混勻，自然pH條件下，加適量復(fù)合生物酶混勻，分別置50，55，60，65，70，75℃恒溫培養(yǎng)箱中酶解24 h。進(jìn)行后處理，升溫至100℃保持30 min，使酶滅活，酶解液離心，棄上清液，沉淀80℃烘干，研碎，得盾葉薯蕷酶解物。按盾葉薯蕷粉末質(zhì)量∶乙醇溶液體積(1∶8)的料液比，在酶解物中加80%乙醇溶液，水浴回流提取2 h，離心，取上清液，沉淀重復(fù)提取1次，合并兩次上清液，定容至100 mL容量瓶中，搖勻，即得樣品溶液，按前文所述方法測定總皂苷含量，并求出總皂苷得率。由圖1可知，70℃以前薯蕷總皂苷得率隨酶解溫度的升高而增大，當(dāng)溫度達(dá)70℃時得率達(dá)最大值，繼續(xù)升高溫度，得率降低，說明70℃時生物酶活性較高。

圖1 酶溫度對總皂苷得率的影響

酶解pH：取盾葉薯蕷粉末7份，每份5 g，加一定量的水混勻，分別調(diào) pH至4．0，4．5，5．0，5．5，6．0，6．5，7．0，加適量復(fù)合生物酶混勻，置70℃恒溫培養(yǎng)箱中酶解24 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。由圖2可知，pH為5．5以前薯蕷總皂苷得率隨pH的增大而增大，當(dāng)pH為5．5～6．0時得率達(dá)最大值，繼續(xù)增大反應(yīng)液pH，得率降低，說明pH為5．5～6．0時生物酶活性較高。

圖2 酶解pH對總皂苷得率的影響

生物酶預(yù)處理水用量：取盾葉薯蕷粉末6份，每份5 g，分別以4，6，8，10，12 L／kg的量加水混勻，調(diào)pH至5．5，加適量復(fù)合生物酶，混勻，置70℃恒溫培養(yǎng)箱中酶解24 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。由圖3可知，生物酶預(yù)處理水用量在4～6 L／kg之間時薯蕷總皂苷得率相對較高，當(dāng)超過6 L／kg時，繼續(xù)增大料液比，總皂苷得率降低，說明水用量在4～6 L／kg較為合適。

圖3 生物酶預(yù)處理水用量對總皂苷得率的影響

酶用量：取盾葉薯蕷粉末5份，每份5 g，以4 L／kg的量加水混勻，調(diào) pH至 5．5，依次按照 2，4，8，12，16 mL／kg的量加復(fù)合生物酶，混勻，置70℃恒溫培養(yǎng)箱中酶解24 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。由圖4可知，薯蕷總皂苷得率隨酶用量的增大而增大，當(dāng)酶用量為8 mL／kg時總皂苷得率為8．64%，繼續(xù)增加酶用量，總皂苷得率增加不明顯，說明酶用量為8 mL／kg較為合適。

圖4 酶用量對總皂苷得率的影響

酶解時間：取盾葉薯蕷粉末5份，每份5 g，以4 L／kg的量加水混勻，調(diào)pH至5．5，按8 mL／kg的量加復(fù)合生物酶，混勻，置70℃恒溫培養(yǎng)箱中分別酶解6，12，24，36，48 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。由圖5可知，薯蕷總皂苷得率隨酶解時間的延長而增大，當(dāng)酶解時間為24 h時總皂苷得率為8．67%，繼續(xù)延長酶解時間，總皂苷得率無明顯增加，說明酶解24 h反應(yīng)較為完全。

圖5 酶解時間對總皂苷得率的影響

工藝驗證：取盾葉薯蕷粉末3份，每份5 g，以1∶4的料液比加水混勻，調(diào)pH至5．5，按8 mL／kg的量加復(fù)合生物酶，混勻，置70℃恒溫培養(yǎng)箱中酶解24 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。結(jié)果總皂苷平均得率為8．86%（n＝3），RSD為1．14%，表明該提取工藝穩(wěn)定可靠。

2．2．2 正交試驗設(shè)計優(yōu)化總皂苷提取工藝

因素水平選擇：參考相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)[12]，提取過程中，料液比（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數(shù)（因素C）、提取溶劑（因素D）是影響薯蕷總皂苷得率的主要因素。取經(jīng)生物酶預(yù)處理后的盾葉薯蕷粉末9份，每份相當(dāng)于5 g盾葉薯蕷，以薯蕷總皂苷的得率為指標(biāo)，采用 L9（34）正交試驗表進(jìn)行試驗，篩選出最佳提取條件。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

試驗結(jié)果分析：由表2可知，上述4個因素對薯蕷總皂苷得率影響的大小順序為：提取次數(shù)（C）＞料液比（A）＞提取時間（B）＞提取溶劑（D）。方差分析結(jié)果顯示，因素C對得率有極顯著性影響，因素A對得率有顯著性影響，因素B和D對得率影響不具顯著性，結(jié)果見表3。

表2 正交試驗設(shè)計表及結(jié)果

表3 方差分析

最佳工藝條件：正交試驗優(yōu)選的提取條件為A3B2C3D1。比較提取2次和提取3次，發(fā)現(xiàn)總皂苷得率增加幅度較小，結(jié)合生產(chǎn)實際，提取條件為A3B2C2D1可能更為合適，即料液比為1∶8，每次提取1．0 h，提取2次，溶劑為60%乙醇溶液。

驗證試驗：取盾葉薯蕷粉末6份，每份5 g，均分為A1，A2兩組，按4 L／kg的量加水混勻，調(diào)pH至5．5，以8 mL／kg的量加復(fù)合生物酶混勻，至70℃恒溫培養(yǎng)箱中酶解24 h，離心，棄上清液，得盾葉薯蕷酶解物。以1∶8的料液比加60%乙醇溶液，回流提取1．0 h，A1組提取2次，A2組提取3次，分別合并提取液，測定吸光度并計算得率。由表4可見，提取2次和提取3次對最終得率無顯著影響（P＞0．05），故總皂苷最佳提取工藝為A3B2C2D1。

表4 最佳工藝驗證試驗結(jié)果

3 討論

3．1 總皂苷得率顯著提高

經(jīng)生物酶預(yù)處理后，薯蕷總皂苷得率與原有工藝相比大幅提高。文獻(xiàn)[3]報道的最優(yōu)工藝條件下，薯蕷總皂苷得率為1．84%（18．4 mg／g），新工藝條件下薯蕷總皂苷得率為9．76%，得率約提高4．3倍。分析認(rèn)為，盾葉薯蕷中大部分皂苷類成分被包裹在占其干重82．5%的淀粉和纖維素中[10]，不易被提取出來，生物酶預(yù)處理使處于緊密包裹中的皂苷類暴露出來，從而提高了總皂苷得率。

3．2 提取溶劑差異分析

本試驗中乙醇濃度考察結(jié)果與文獻(xiàn)報道存在較大差異。文獻(xiàn)[13]報道，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對總皂苷得率有顯著性影響(P＜0．05)，體積分?jǐn)?shù)為80%時得率最大，而在相同因素同一水平下。本試驗結(jié)果顯示，乙醇濃度對總皂苷得率無顯著性影響(P＜0．01)。這可能與本試驗對盾葉薯蕷進(jìn)行酶預(yù)處理有關(guān)，一方面酶預(yù)處理后總皂苷更容易被提取出來，一定范圍內(nèi)的濃度變化對總皂苷得率無顯著性影響；另一方面可能是因為酶預(yù)處理所提取的皂苷類成分發(fā)生改變，一些緊密包裹在淀粉和纖維素中帶糖基多、水溶性大的皂苷被提取出來[14－15]，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3．3 提取次數(shù)選擇

通過驗證，將提取次數(shù)設(shè)定為2次。正交試驗極差分析結(jié)果顯示，提取次數(shù)對總皂苷得率影響較大，方差分析結(jié)果顯示提取次數(shù)對總皂苷得率有顯著性影響，但對正交試驗結(jié)果進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，提取2次與提取3次相比 K值增加不明顯（K3－K2＝0．50）。結(jié)合生產(chǎn)實際，提取次數(shù)增加1次，能耗、提取溶劑、提取時間均會大幅增加，因此考慮將提取次數(shù)設(shè)定為2次。工藝驗證結(jié)果顯示，提取2次和提取3次薯蕷總皂苷得率無顯著性差異，故提取2次更為合理。

參考文獻(xiàn)：

[1]雷 震，雷 攀，杜士明，等．盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的不同提取方法比較研究[J]．中國藥業(yè)，2015，24(22):24－26．

[2]楊如同，唐世蓉，潘福生，等．藥源植物盾葉薯蕷甾體皂苷及皂苷元的研究進(jìn)展[J]．中國野生植物資源，2007，26(4):1－5．

[3]Su JX，Wei YH，Liu ML，et al．Anti－h(huán)yperuricemic and nephroprotective effects of Rhizoma Dioscoreae septemlobae extracts and its main component dioscinvia regulation of mOAT1，mURAT1 and mOCT2 in hypertensive mice[J]．Arch Pharm Res，2014，37(10):1 336－1 344．

[4]Chen H，Xu LN，Yin LH，et al．iTRAQ－based proteomic analysis of dioscin on human HCT－116 colon cancer cells[J]．Proteomics，2014，14(1):51－73．

[5]Pan CH，Tsai CH，Liu FC．Influence of different particle processing on hypocholesterolemic and antiatherogenic activities of yam (Dioscorea pseudojaponica)in cholesterol－fed rabbitmodel[J]．J Sci Food Agric，2013，93(6):1 278－1 283．

[6]王曉榮，李勇健，程彬彬，等．薯蕷皂苷元抗腫瘤作用及其機(jī)制研究[J]．西部中醫(yī)藥，2014，27(5):140－143．

[7]馬海英，趙志濤，王麗娟，等．黃山藥總皂苷和薯蕷皂苷元抗高脂血癥作用比較[J]．中國中藥雜志，2002，27(7):528－531．

[8]王 悅，晁芳芳．黃姜皂素的清潔生產(chǎn)工藝研究及資源綜合利用[J]．咸陽師范學(xué)院學(xué)報，2012，27(2):35－37．

[9]許麗娜，衛(wèi)永麗，彭金詠．天然產(chǎn)物薯蕷皂苷的研究進(jìn)展[J]．中國中藥雜志，2015，40（1）：467－470．

[10]朱余玲，黃 文，劉 葳，等．利用里氏木霉生物轉(zhuǎn)化制備黃姜薯蕷皂甙元的清潔新工藝[J]．北京大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010，46（4）：661－666．

[11]王光忠，劉偉偉，葛如斌，等．分光光度法測定盾葉薯蕷總皂苷的含量[J]．湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，10（2）：44－45．

[12]張裕卿，王東青，李濱縣，等．階梯生物催化協(xié)同提取盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的研究[J]．中草藥，2006，37（5）：688－691．

[13]王光忠，張 明，夏 兵，等．正交設(shè)計法優(yōu)選盾葉薯蕷總皂苷的提取工藝[J]．中國藥師，2007，10（10）：998－999．

[14]Qi SS，Dong YS，Zhao YK，et al．Qualitative and quantitative analysis of microbial transformation of steroidal saponins in Dioscorea zingiberensis[J]．Chromatographia，2009，69(9):865－870．

[15]牛春玲，吳勝舉，沈壯志，等．盾葉薯蕷總皂苷超聲提取及動力學(xué)[J]．生物加工過程，2009，7(4):20－23．

Extraction Process of Enzyme Pretreatment M ethod for Extracting Total Saponins from Dioscorea

Yang Guangyi1,Lei Pan1,2,Du Shiming1,2,Hui Xiaona1,Ye Fang1,Zhang Chenning1,Wei Jinbao1
(1．Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan Hubei,China 442000; 2．Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan,Hubei,China 430065)

Objective To establish a highly efficient extraction method for the saponins extracted from dioscorea zingiberensis．M ethods Evaluated by the yield of the saponins,the 5 factors,namely temperature,pH,water consumption,dosage of enzyme and enzyme hydrolysis time in the process of enzyme pretreatment were optimized via single factor experiment,and the 4 factors,namely ethanol concentration, ratio of solid to liquid,extracted time and extraction degree in the saponins extracion process were optimized via orthogonal experiment．Results The best conditions in the enzyme pretreatment are as follows:the temperature for the enzyme was 70℃,pH 5．5,water consumption was 4 L／kg,dosage of enzyme was 8 mL／kg,enzyme hydrolysis time was 24 h;the best conditions in the saponins extracted process wereas follows:ethanol concentration 60%,ratioof solid toliquid 1:8,extraction time 1．0 h,extraction degree twice．Conclusion The optimal conditions can extract the saponins from dioscorea zingiberensis stably．

dioscorea;enzyme pretreatment;total saponins;extraction process

R284．1；R282．71；TQ461

A

1006－4931(2016)09－0008－05

楊光義，男，博士研究生，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向為中藥資源開發(fā)和新藥研究，（電子信箱）ygy996＠163．com。

2016－01－10)

2013年湖北省科技支撐計劃（對外科技合作類）項目，項目編號：2013BHE017；2014年湖北省教育廳中青年創(chuàng)新團(tuán)隊項目，項目編號：T201414。